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课题性质 |
radic; 基础研究 应用课题 设计型 调研综述 理论研究 |
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开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字） 拟研究或解决的问题:通过对ZEN毒素的提纯方法的建立与优化，为后续试验中富集筛选ZEN降解菌提供较纯的降解底物；为ZEN降解、筛选等实验的测定提供了灵敏、可靠的分析方法和试验数据；同时也保证了后续实验的顺利进行。 采用的研究手段为：将培养好的小麦烘干，粉碎成粉状，加入一定比例乙腈和水溶液，然后摇床震荡或均质超声提取。将提取后的液体过滤到分液漏斗中，用固相萃取柱净化，氮吹干后，再用甲醇进行溶解，即得ZEN的粗毒素。 本实验通过固相萃取柱进行纯化，用提取液活化净化柱，活化后，将提取液转移至柱中进行纯化，最后对所得的纯化毒素进行HPLC或LC-MS/MS检测。 其中乙腈和水的体积比分别设置为1/4、2/3、3/2、4/1和9/1，作为实验中提取溶剂的变量，来研究溶剂对小麦中玉米赤霉烯酮的提取的最好的用量比。 提取过程中摇床的时间分别设置为5,10,15,20,25,30,60,90,120min，作为实验中摇床提取时间的变量，来研究不同摇床时间对小麦中玉米赤霉烯酮的提取效果。 提取过程中均质的时间分别设置为10,20,30,40,60,90,120,300s,作为实验中匀质提取时间的变量，来研究不同摇床时间对小麦中玉米赤霉烯酮的提取效果。 文献综述：
玉米赤霉烯酮(Zearalenone , ZEN)，又称 F-2 毒素，其产毒菌主要是镰刀菌属的菌株，如禾谷镰刀菌和三线镰刀菌、黄色镰孢、木贼镰孢、半裸镰孢、茄病镰孢等菌种。该毒素广泛存在于霉变的玉米、高粱、小麦、燕麦、大麦等谷类作物以及奶类中。ZEN由于具有类雌性激素毒性，不仅影响食物安全，而且可以通过食物链在人体或动物体中蓄积，通过影响机体的生殖性能，引起细胞凋亡、致畸、损伤DNA、氧化损伤、影响免疫机能等机制，来影响和危害人类与动物的健康。ZEN本身具有分布广、繁殖快、耐热、代谢产物多、毒性大、残留时间长、难处理等问题，正在引起全世界的关注。 1.1 玉米赤霉烯酮的污染 玉米赤霉烯酮(Zearalenone, ZEN)是世界上污染最广泛的一种镰刀霉毒素，在欧洲、非洲、亚洲、北美洲、南美洲以及大洋洲等世界各地的谷物以及农副产品中都检测到ZEN的存在，其污染的范围比较广，涉及污染的品种非常多。 1.2 玉米赤霉烯酮的产生条件 产生真菌ZEN毒素的主要原因是由于作物的耕作、收获、运输和贮存期间温度适中而湿度较高时易于镰刀菌滋生产毒所致。镰刀菌的生长、产毒与环境条件关系密切。在冷暖交替时镰刀菌产毒能力较强，秋收季节常有显著的温度变化，可为镰刀菌的生长和产毒提供适宜条件。真菌ZEN毒素产生的最适环境条件为： Ⅰ.产生该毒素菌株的最适生长温度为：24~32℃； Ⅱ.产生该毒素菌株的最适湿度为：含水量为22%~25%； Ⅲ.产生该毒素菌株的最适需氧量为，含氧量要大于3%。 虽然镰刀菌属霉菌侵染生长中的谷物能够在收获前蓄积ZEN，但有研究表明，作为饲料原料的谷物含有高浓度的ZEN主要是由存储不当造成的。 1.3 玉米赤霉烯酮的结构及理化性质 ZEN是一种酚的二羟基苯酸的内酯结构，其分子式为 C18H22O5，分子量318，熔点161~163℃，耐热性强。ZEN为白色晶体，不溶于水、二硫化碳和四氯化碳，溶于碱性水溶液、乙醚、苯、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、醇类和酸类，微溶于石油醚。ZEN的甲醇溶液在紫外光下呈明亮的绿-蓝色荧光。
目前，对于提取的方法，国内一般采用的是用有机溶剂或有机溶剂-水体系提取，然后用液液萃取，固相萃取净化。本实验的方法如下：对小麦样品进行烘干、粉碎。称量后加入一定量的乙腈和水，置于摇床震荡或者均质超声提取。将提取后的液体过滤到分液漏斗中，用固相萃取柱净化，氮吹干后，再用甲醇进行溶解，即得ZEN的粗毒素。 本实验中，乙腈和水的体积比、提取过程中摇床的时间、以及提取过程中均质的时间作为实验变量，通过实验得到小麦中玉米赤霉烯酮的最佳提取条件。 3.玉米赤霉烯酮的检测 目前，对于测定已经提取净化好的玉米赤霉烯酮的方法有：薄层色谱法（TLC）、气相色谱法（GC）、液质联用检测法(LC-MS)、酶联免疫法（ELISA）和高效液相色谱法（HPLC）等。 薄层层析检测法(TLC)，是将适宜的固定相涂布于玻璃板上，成一均匀薄层。经点样、适宜的展开剂展开后，与适宜的对照物按同法所得的色谱图作对比，用以进行物质的鉴别，杂质检查或含量测定的方法。《GB/T19540–2004 饲料中玉米赤霉烯酮的测定》规定，用薄层色谱法作为仲裁法检测饲用谷物原料和配合饲料中ZEN含量，最低检测限为0.02mu;g。这种方法操作简单、成本低、无需价格昂贵仪器，但灵敏度和特异性较差。所以对于本实验不太适用。 气相液相色谱法（GC），是使混合物中各组分在两相间进行分配，其中一相为固定相，该相为不动相；另一相为流动相，该相携带混合物流经固定相并与固定相发生作用，在同一推动力下，根据不同组分在固定相中的滞留时间不同，依次被分离出来。利用GC-MS法检测饲料中ZEN的含量时，最低检出限为50ng，其添加回收率均在80%以上。虽然该方法具有广泛的应用范围，方法灵敏度较高，但是设备的实用性问题还是决定了它们不适合作为常规方法进行应用，通常不作为常规方法检测。 液质联用（HPLC-MS）又叫液相色谱-质谱联用技术，它以液相色谱作为分离系统，质谱为检测系统。样品在质谱部分和流动相分离，被离子化后，经质谱的质量分析器将离子碎片按质量数分开，经检测器得到质谱图。液质联用体现了色谱和质谱优势的互补，将色谱对复杂样品的高分离能力，具有高选择性、高灵敏度及能够提供相对分子质量与结构信息的优点。孟娟等运用LC-MS法测定粮食及其制品中ZEN的含量，检出限为0.1~0.2mu;g/kg[3]故使用于本实验的微量检测。 酶联免疫检测法（ELISA），是采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，通过酶与底物产生颜色反应，进行样品定量测定。目前，国外已有商品化的ZEN检测试剂盒问世。德国拜发生产的ZEN快速检测试剂盒操作简单，灵敏度为50ng/g，但是价格太昂贵，在国内应用不是很普遍。 高效液相色谱法（HPLC），是用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，经进样阀注入供试品，由流动相带入柱内，在柱内各成分被分离后，依次进入检测器，色谱信号由记录仪或积分仪记录。HPLC法具有灵敏度高、检测限低、自动化程度高等优点。隋凯等建立了玉米和小麦中ZEN的多功能柱净化HPLC检测方法，最低检测限为0.04mu;g/g[8] ，非常适合本实验的微量样品检测。 故本实验可以采用高效液相色谱法或者液质联用法来检测提取后的玉米赤霉烯酮。 4.本研究的意义 基于上述ZEN毒素污染的普遍性以及对人畜的高度危害性，ZEN毒素的降解脱毒研究显得迫切和重要了。本实验通过对ZEN毒素的提纯与HPLC检测条件的优化，为后续试验中富集筛选ZEN降解菌提供较纯的降解底物；为ZEN降解率测定提供了灵敏、可靠的分析方法和试验数据；同时也保证了后续实验的顺利进行，从而减少玉米赤霉烯酮对人类健康的危害。 参考文献： [1] 曾红燕,黎源倩,敬海泉.高效液相色谱法测定粮食中玉米赤霉烯酮及其代谢物[J].2006 (3):351-354. [2] 李鹏,董广彬,顾鑫荣等.液相色谱-串联质谱法测定食用油中的玉米赤霉烯酮[J].分析仪器,2009(5):27-29. [3] 孟娟,张晶,张楠等.固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法检测粮食及其制品中的玉米赤霉烯酮类真菌毒素[J].色谱,2010,28(6:)601-607. [4] 梁颖,刘邻渭,张春晖等.液质联用同时检测小麦中三种镰刀菌毒素[J].中国粮油学报, 2006,21(6):160-162. [5] 邓友田，袁慧.玉米赤霉烯酮毒性机理研究进展[J].动物医学进展,2007,28(2):89-92. [6] 朱孟丽,彭聪,洪振涛.高效液相色谱法对饲料中玉米赤霉烯酮的测定[J]饲料工业,2007, 28(1):37-38. [7] 白清云.高效液相色谱法测定玉米中玉米赤霉烯酮( ZEN) 残留[J].农业环境保护,1998, 17(1) :26-31. [8] 隋凯,李军,郑江.多功能柱净化一高效液相色谱法检测谷物中的玉米赤霉烯酮[J].分析试验室,2006 ,25(1) :99-102. [9] 张辉珍,马爱国,李慧颖等.免疫亲和层析净化高效液相色谱法测定玉米赤霉烯酮[J].理化检验化学分册工作简报,2009,45(11):1323-1325. [10] 杨小丽，杨美华，欧阳臻。玉米赤霉烯酮及其衍生物分析方法的研究进展[J].贵州农业科学,2011,39(7):234-238. [11] 冯永建,何学超,郭道林等.玉米赤霉烯酮的液相色谱法检测技术研究[J].粮食储藏,2008, 37(4):45-48. [12] 谢刚,杨卫辰,李荣涛等.用免疫亲和柱荧光检测法检测饲料及饲料原料中玉米赤霉烯酮[J].粮食饲料与工业,2005,3:44-45. [13] 单妹,许梓荣,冯建蕾.玉米赤霉烯酮对家畜繁殖性能和人体健康的影响[J].江西饲料, 2006,33(1):28-31. [14] 王怡净,张立实.玉米赤霉烯酮毒性研究进展[J].中国食品卫生杂志,2002,14(5):40-42. [15] 陈必芳,李兰.饲料中镰刀菌毒素DON、T-2和ZEN气相色谱测定方法研究[J].中国饲料,1995(10):32-34． [16] Stob M.Isolation of an anabolic uteritrophic compound from corn infected with Gibberella gene[J]. Nature,1962,196:1318. [17] Kuiper-Goodman,Scott T P M,and Watanabe H.Risk assessment of the mycotoxin zearalenone[J]. Regul.Toxicol Pharmacol.1987,7: 253-306. [18]L.C.Huang,N,Zheng,B.Q.Zheng,F.Wen,J.B.Cheng,R.W.Han,X.M.Xu,S.L.Li,J.Q.Wang.Simultaneous determination of aflatoxin M1,orchratoxin A,zearalenone and a-zearalenol in milk by UHPLC-MS/MS[J].Food Chemistry.2014,146:242-249. |
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