研究背景和立题依据
免疫佐剂又称非特异性免疫增生剂，可非特异性地与特异性免疫原性物质结合，诱发机体产生长期、高效的特异性免疫反应，提高机体保护能力，同时又能减少免疫物质的用量，降低疫苗的生成成本[1]。
鞭毛蛋白是细菌鞭毛的主要组成蛋白，根据鞭毛蛋白基因结构与功能将鞭毛蛋白分为四个区域，即高度保守的N-末端和C-末端(D0，D1区)和高度变异的中间部分（D2，D3区）[2]，这些复杂的表面复合物与细菌运动有关，同时也与诱导特异性免疫应答相关联。机体对外来抗原物质如对病原微生物的识别是由细胞的特定受体介导的。目前已证实，这一识别主要是通过细胞表面的Toll样受体（Toll-like receptor,TLRs）家族分子来实现的。TLRs可识别病原微生物高度保守的结构基序，即所谓的病原相关分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMPs)，并诱导产生天然免疫应答[3]。特定的TLRs可以识别相应的PAMPs，其中鞭毛蛋白高度保守的D0，D1区能以配体受体识别的方式激活表达TLR5受体的APC，如树突状细胞（DC），巨噬细胞以及肠上皮细胞，诱导分泌前炎性因子及细胞因子，进而介导激活T细胞和B细胞应答[4-5]；而高度变异的D2，D3区的抗原性能刺激机体产生特异性的免疫反应[6]；细菌鞭毛蛋白作为佐剂不仅可使机体产生特异性的体液和细胞免疫，越来越多的研究显示鞭毛蛋白还能通过TLR5受体调节黏膜免疫反应[7-8]。细菌鞭毛蛋白与TLR5受体结合后，主要是通过髓样分化因子MyD88激活白介素受体相关激酶(IRAK4)和肿瘤坏死因子受体相关因子6 (TRAF6)，TRAF6被磷酸纤维素化后，诱导转化因子beta;活化激酶1（TAK1）和促分裂原活化蛋白酶MKK6，激活下游的NF-kappa;B、JNK和促分裂原活化蛋白激酶(MAPK) p38信号通路，诱导促炎细胞因子如IL-6、IL-12及TNF-alpha;等基因的表达。目前，鞭毛蛋白已作为一种有效的免疫佐剂用于各类疫苗的研究中，如尿道致病性大肠埃希菌（Uropathogenic Escherichia coli, UPEC）[9]，抗鼠疫(耶尔森氏)杆菌（Yersinia Pestis）[10]、疟原虫（Plasmodium falciparum）[11]、破伤风梭菌（Clostridium tetani）[12]、西尼罗病毒（West Nile viruses）[13]等疫苗的研究。
Hp中的鞭毛蛋白在Hp的定植过程中起着至关重要的作用，能够通过摆动提供动力，帮助Hp穿过黏液层，到达胃上皮表面适合其生存的微氧环境，是影响Hp定植及感染持续存在的重要因素。但是，由于Hp鞭毛蛋白因其结构特殊性，虽然能引发机体产生特异性的抗体反应，却不能被APC上的TLR5识别，刺激机体产生有效的黏膜免疫应答，从而逃避了机体的免疫监督形成持续感染[14]。
如何解决Hp鞭毛蛋白不能有效调节黏膜免疫的问题以及能否改造Hp鞭毛蛋白使其做为Hp疫苗的生物佐剂，使其既能刺激机体产生体液和细胞免疫，又能调节黏膜免疫反应，有效清除Hp胃黏膜感染，抑制Hp胃部定植，增强疫苗治疗Hp感染的效果，成为Hp疫苗研究的一个新的思路。根据国内外研究报道，鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白Flic高度保守的D0，D1区能以配体受体识别的方式激活TLR5，调控TNF-alpha;、IL-6和IL-12等促炎细胞因子的合成，具有很好的免疫佐剂功效，已经应用于流感疫苗、鸡瘟疫苗等病原体疫苗研究中，其中与Flic融合表达的两个流感病毒疫苗已经进入Ⅱ期临床实验。
本课题选择能与TLR-5结合的沙门菌鞭毛蛋白Flic的D0和D1区与幽门螺旋杆菌鞭毛蛋白FlaA的D2，D3区域相结合形成新型嵌合鞭毛蛋白（CF）。这种新型嵌合鞭毛蛋白即保留了自身抗原特性，又获得了能通过TLR-5以配体受体识别方式激活APC，诱导分泌前炎性因子及细胞因子，进而介导激活体液、细胞和黏膜免疫应答的能力。新型嵌合鞭毛蛋白(CF)作为分子内佐剂应用于Hp多表位疫苗CTB-UE中，能够通过高度保守的D0和D1区刺激TLR-5发挥佐剂效应结合高度变异的D2，D3区所表现出来的自身抗原性，这种双重作用能够更为有效的刺激机体的免疫系统，清除病原体的感染，从而提高Hp多表位疫苗CTB-UE的免疫原性，清除Hp在胃粘膜处的定植，增强疫苗防治Hp感染的效果。
具体实验内容：
1.新型嵌合鞭毛蛋白（CF）的设计及分子构建
