高表达IDO1肿瘤细胞的微流控检测方法文献综述

开题报告内容：

一、 课题背景及文献综述

微流控是指在至少一维为微米甚至纳米尺度的低维通道结构中操控体积为皮升或纳升的流体进行流动并且传质传热的技术^[1]。流体在低维通道结构中会产生特殊的流体现象，如层流和液滴。两种互不相容的液体在微通道中分别作为分散相和连续相，当两相在微通道中流动的时候，分散相受到界面张力和分散相的剪切力而形成高度均一分散的液滴。液滴微流控是在封闭的通道中操控微小体积的液滴，因此具有以下的优点^[2]：（1）良好的重现性，每一个液滴作为单独的反应体系，使液滴中的样品不受干扰，不易发生交叉污染，所以一定程度上提高了实验结果的重现性；（2）混合速度快，在通道尺寸在微米级时，通道内连续的流体将呈层流状态，此时难以实现快速混匀，但滴液能在蜿蜒的通道中快速混匀；（3）样品与试剂的消耗量少，液滴的体积一般在纳升或皮升级别，在保持浓度不变的情况下，样品与试剂只存在液滴中，无需像连续相充满整个管道，减少了样品与试剂的浪费；（4）易于精确操控，在通道内，曳地的运输，融合，分裂等都可以通过程序来进行精确的操控。基于液滴微流控的优点，广泛运用于药物运输，单细胞分析，材料合成等诸多领域^[3]。

液滴的生成主要在于施加足够大的作用力来扰乱连续相和分散相的界面张力，使其达到一个不稳定的状态，有助于分散相突破连续相的界面张力进入其中形成液滴^[4]。根据连续相和分散相的性质不同，可分为油包水（W/O）型和水包油（O/W）型的液滴。微液滴的制备方法可归纳分为三种^[5]：T型通道法，十字型流体聚焦法，和同轴流法。这三种方法通过调节流体速度，都可制备大小稳定均一的液滴。

由于液滴的大小与细胞体积相近，对于单细胞的操控和分析非常有帮助，同时微尺度通道具有传质传热快的优点，这也为细胞提供了一个良好的研究环境，再加上，微液滴所需的细胞和试剂量少，分析速度快，有利于从高通量的细胞中获取大量生物信息^[4]。在进行单细胞包裹时，要求每个细胞最多只能封装一个细胞，封装的过程遵循泊松分布^[6]:f(lambda;:n)= lambda;ⁿe^_lambda;/n!,其中n为液滴中的细胞数，lambda;为平均每个液滴的细胞数。可以通过改变细胞密度来调整lambda;的值，以确保有很少的液滴包含多个细胞，同时也会有大量的液滴不含有细胞，含有单个细胞的液滴数也较少，但是由于微流控装置有较高的生产与筛选率，所以影响并不大。分散相与连续相的流速以及通道的喷嘴尺寸对液滴的大小以及液滴产生的频率有着不可忽视的影响，当液滴直径在10-150mu;m的时候，液滴的体积约在0.5-1800pL。随着细胞在液滴内培养时间的增长，液滴内营养物质的减少，代谢废物的增加均对于细胞的存活有着不良影响，有研究表明，当液滴体积在33pL时，细胞在6小时内仍能保持80%以上的存活率^[6],与在培养皿上的细胞存活率并无大的差别，而减小液滴的体积则细胞的存活率明显下降，合适的液滴体积有助于细胞的存活。另外，细胞的代谢也不受影响^[6]，将细胞从液滴中提取出来后，细胞仍然可以在培养皿中生长，与正常细胞没有差别。基上所述，尽管细胞被封装在了液滴中，但细胞的存活，代谢以及恢复后的增殖都能够正常进行，液滴微流控完全可以用于单细胞分析。

在使用微流控作为高通量手段时，试剂的加入是必不可少的环节，pico-injection技术可以帮助实现将试剂精准的加入到液滴中并且与其他的生物反应有良好的相容性^[7]。Picoinjector 由一个包含待添加试剂的加压通道和一个正负电极组成，当液滴流过picoinjector 时，电极通电，这会破坏水/油界面的稳定性，使试剂进入液滴。Picoinjector 保持在高压下，使液体注入液滴中。当液滴继续流动时，它通过一个狭窄的液桥与picoinjector 的孔口相连接。最终这座桥变得不稳定并断裂，液滴脱落。一旦远离电场，液滴就会恢复其稳定性，即使在接触时也不会合并。通过调节滴速和注射压力，可以控制注射量。通过打开和关闭电场，可以调节注射的速度^[8]。Pico-injection使得高通量的液滴微流控技术有了更加广泛的应用。

循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs），是指从实体肿瘤原发病灶或转移病灶脱落，进入循环系统并参与肿瘤疾病进展、转移、复发的肿瘤细胞亚群^[9]。CTCs的检测有可能帮助临床医生较为准确地进行肿瘤的早期诊断、预测转移或复发，对于CTCs的研究具有重要意义^[10]。目前CTCs的检测方法主要依赖于CTC的物理和生物学特性，分别有^[11]：1.基于核酸表达的检测方式，由于CTC的核酸成分与血液中其他的DNA,RNA有所不同，因此对血液中的核酸进行分离纯化后可进行检测，但这种方法会受到血液中其他细胞以及检测过程中外界的干扰，灵敏度较低。2.基于CTC物理特性的检测方式，通常认为CTC相较于血液成分细胞具有更大的体积、更高的密度且表面电荷分布区别于其他细胞，同时部分CTC还可能表现出不同的细胞活性以及特殊色素沉着等特性，这些差异特性逐步被认识并用于进行相应细胞的检测及筛选，这种方法同样也受到各种因素的干扰，难以准确测量，但其优势在于成本低，时间短，无荧光抗体干扰，并且细胞可用于后续的生物学验证以及细胞分析。3.基于细胞表面抗体的检测方式，在外周血中，大部分上皮细胞被认为是来源于上皮恶性肿瘤细胞，上皮细胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule, EpCAM）表达于几乎所有上皮来源的细胞而不表达于血液成分细胞，因此它是一个十分理想的检测靶点。CellSearch系统（Veridex，Warren，NJ，USA）是通过检测上皮特异性黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）或细胞因子（cytokines，CKs）等上皮细胞肿瘤标志物来检测CTCs的一种常用手段，检测结果中将EpCAM阳性而CD45阴性表达的细胞亚群定义为CTC。这种检测方法目前应用广泛，但仍然有灵敏度低，所需样本量大的缺点。现在，越来越多基于细胞表面标记的CTC检测方法进行试验并加以临床运用，其中多通量流式细胞技术因其高通量的特点可进行一些极其稀少细胞的检测，而多荧光通道的运用可实现多表面抗体细胞的特异性筛选及检获^[12]，然而研究出操作性更强，更加灵敏的检测方法仍是未来的研究重点。

本次课题拟将吲哚胺2,3-双加氧酶1（IDO1）作为一个CTC的新的靶点进行研究。IDO1是位于胞浆内的由403个氨基酸构成的含有亚铁血红素的酶。在正常的生理状态下，IDO1在各个器官中均有广泛的表达^[13]，它使色氨酸转化为犬尿氨酸和其他的代谢产物，并且是此过程的限速酶^[14]。在肿瘤微环境包括肿瘤细胞，树突细胞（DCs）和巨噬细胞中，IDO1呈现异常表达，从而导致色氨酸衰竭，色氨酸-转运核糖核酸累积，激活了一般性调控遏制蛋白激酶2（GCN2），进一步抑制了T细胞的增值和功能^[15]，并且其他的代谢产物也会诱导调节性T细胞的生成，DCs和巨噬细胞向免疫抑制表型的转化等^[16]或者直接抑制T细胞的作用。此外正常状态下，IDO1在机体受到感染时，为了保护宿主而抑制了机体的固有的免疫反应，以平衡免疫反应。而在肿瘤微环境中，肿瘤细胞的局部炎症和T细胞激活信号激活了IDO1的表达，抑制了免疫反应，称之为IDO1的反向调节，这使肿瘤细胞发生了免疫逃逸，对肿瘤治疗非常的不利^[14]。基于以上发现，研究人员认为IDO1抑制剂的开发可以使肿瘤的治疗效果得到改善，具有良好的开发前景，已经有许多与IDO1抑制剂相关的研究在进行着，其中多采用IFN-gamma;诱导细胞过度表达IDO1^[17]，用于抑制剂的筛选，再结合RT-PCR与Western blot来检测IDO1的表达情况。近年来，已有部分IDO1的抑制剂进入了临床研究阶段，如indoximod, NLG919, INCB024360^[18]。随着研究的深入进行，相信会有更多的抑制剂被开发并投入使用。

基于IDO1的特性，为了更好的研究其反应机理，筛选抑制剂，以及对于恶性肿瘤细胞的分析，对IDO1的表达的检测是非常重要的。近年来，以大环为主体的主客体超分子的荧光分子探针由于其方便，灵敏，可视化等优点^[19]，逐渐受到更多的关注。此荧光探针将大环分子与具有荧光发光基团的分子相结合，大环分子主要有冠醚(crown[n]ether)^[20],环糊精(cyclodextrin, CD)^[21],杯芳烃(calix[n]arene)^[22],葫芦脲(cucurbit[n]uril)^[23]及柱芳烃(pillar[n]arene)^[24]。可检测的物质也是多种多样，如阳离子，阴离子，生物大分子和有机小分子等。首先客体分子通过识别作用嵌入主体分子中形成主客体超分子，再以主客体超分子的形式对检测物质进行定性或定量分析，当待测物质与探针结合进入空腔后，会引起荧光强度改变而达到检测目的。葫芦脲作为大环主体已经有了广泛的运用，在CB[8]空腔内可以结合两个客体分子，如带正电荷的烷基离子以及芳氨基离子，紫罗碱，碳烷和萘等^[25]，并且由于双电荷阳离子，如MP² ，有富含电子的苝核和缺电子的外围，使得它们的结合具有变色龙般的性质，可以用于组装荧光传感器^[26]，如MP与CB[8]结合，荧光增强，当大环的剩余空间与具有芳基官能团的物质，如色氨酸，结合时，荧光发生淬灭，从而实现物质的检测。

二、 拟研究的问题

1． 将高表达IDO1和不高表达IDO1的细胞混合，模拟CTC,研究IDO1是否可以作为CTC检测的新靶点。

2． 采用微流控技术包裹细胞，培养细胞，并将荧光探针(MPTrp)@CB[8]打入液滴中，根据荧光强弱筛选出高表达IDO1的细胞，并采用RT-PCR对筛选出的细胞进行检测，判断其是否高表达了IDO1，验证液滴微流控技术检测高表达IDO1细胞的准确性。

三、 采用的研究手段

1. 用IFN-gamma;诱导细胞过度表达IDO1，将高表达IDO1和不高表达IDO1的细胞混合，模拟CTC；

2. 用液滴微流控技术包裹CTC，培养细胞，高表达IDO1的细胞会加速代谢色氨酸Trp;

3. 将(MPTrp)@CB[8]探针使用pico-injection技术打入液滴里，高表达的细胞会消耗探针中的Trp，导致荧光增强；

4. 根据荧光的强弱使细胞走不同的通道，将高荧光和低荧光的细胞分开，实现细胞的分选。

5. 对高荧光细胞进行R-PCR分析，检验高荧光细胞是否为高表达的细胞。

四、参考文献

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