- 实验背景
人类在环境保护、食品安全监督、重大疾病的诊断和防治中，对病毒、食品添加剂、药物、以及生物大分子的检测鉴定方面迫切需要一些快速简易的检测方法。
化学和生物传感器是由分子识别器和换能器组装起来的一种快速识别系统，能将待检测的生物信号转化为电信号等可检测的信号，再利用信号放大装置放大信号，能对待测物起到定性、定量检测的目的。基于它灵敏、快速、简易等一系列的优点，近年来生物传感器的研究以及对新型的生物传感器的发现成为科研热点。人们普遍使用比色法、荧光法以及电化学光方法对各种待测成分进行测定，其中比色法由于可直接肉眼观察不需要大型贵重仪器成为目前最为常用简单的一种检测方法[1]。本实验拟利用近年来新发展起来的一种具有变色性能的聚联乙炔囊泡生物传感器对药品美托洛尔进行定量检测。
在254 nm紫外光的照射下，有序排列的联乙炔分子能够发生聚合反应，通过1,4加成反应生成聚联乙炔分子（polydiacetylene），自发形成囊泡。可见光激发囊泡中聚联乙炔骨架的离域pi;电子，产生pi;－pi;*跃迁，因而聚联乙炔分子在可见光区域有很强的吸收峰，最大吸收峰在640 nm附近，呈现为蓝色溶液，而且基本均一稳定。当囊泡感受到刺激时（环境温度变化、溶液pH变化、压力、溶剂的极性、表面活性剂和生物分子识别反应等），聚合物骨架构象发生变化，pi;电子状态发生变化，会有明显的颜色变化，溶液由蓝色变为红色，最大吸收从640 nm附近蓝移至540 nm附近。聚联乙炔由蓝色变为红色的程度可以用比色响应（colorimetric response简写CR）值来表示[2]，CR%=[(PB0-PBf)/PB0]times;100%，而PB=ABlue/(ABlue ARed)，A是蓝色聚联乙炔对红波的吸收强度或者红色聚联乙炔对蓝波的吸收强度。PB0是初始状态下聚联乙炔对红波吸收所占百分比，PBf是外界刺激之后聚联乙炔对红波吸收所占百分比。CR值越大，表明囊泡颜色越红，即对外界刺激的响应越强烈。由于聚联乙炔囊泡具有肉眼可观察的变色现象及使用仪器测定CR值定量测定等优点，使得聚联乙炔作为生物传感器在药物分析以及食品安全分析领域拥有广阔的应用前景。
聚联乙炔（PDA）的表面分子在结合特定分子时，可使颜色从蓝色转变为红色。PDA分子具有两性，如果在其表面插入一些特定的探针，在探针与特异性的分子相互作用时，发生颜色的变化。PDA是联乙炔分子发生聚合反应形成的，我们也可以在联乙炔聚合前将分子探针通过合成反应修饰到联乙炔分子上，再将修饰后的联乙炔聚合形成囊泡，这样形成的囊泡表面也会含有大量的探针（本实验即采用此方法）。
美托洛尔（Metoprolol），是一种临床上常用的beta;1受体阻滞药，近年来试用于治疗慢性心力衰竭等疾病，取得了较好的疗效； 并有大量临床研究证实，beta;受体阻滞药可减少高危患者或心血管手术患者心血管并发症的发生率， 是一种安全有效的预防措施[3]。常用其酒石酸盐，为白色或类白色的结晶性粉末；在水中极易溶解，在乙醇或氯仿中易溶，在无水乙醇中略溶，在丙酮中极微溶解，在乙醚或苯中几乎不溶；在冰醋酸中易溶。《中华人民共和国药典》[4]中对于其检查方法为薄层色谱法和高效液相色谱法（用十八烷基硅烷键合珪胶为填充剂；以醋酸盐缓冲液-乙腈（824：146) 为流动相；柱温30 ℃；检测波长为280 nm，洒石酸美托洛尔对照品。在以前十多年的研究中，分析工作者开发出了大量美托洛尔生物样品的测定方法，主要包括毛细管电泳、GC-MS、LC-MS、HPLC-UV[5-10]等，为美托洛尔体内药动学的研究作出了很大贡献，但是这些方法均在一定程度上存在局限性。气相色谱法、LC-MS方法是高效能、高选择性和高灵敏度的分析方法,但对样品的理化性质有一定的要求，有的药物需要衍生化，分析耗时长，且对于难气化的样品难处理甚至不能用该方法进行分析检测；高效液相色谱法解决了操作复杂及结构相似的杂质干扰测定等问题，但其紫外或突光检测器却需要较大样品量，且灵敏度往往不能满足美托洛尔的体内测定要求。由上述可知，这些方法普遍存在样品制备过程繁琐，对样品中被测成分的纯度有严格的要求，样品需求量大等问题。因此在美托洛尔的研究中急待建立一种方便、快速且灵敏的分析方法。
免疫法检测主要是利用抗原和抗体的特异性反应进行检测的一种手段，具有较高的灵敏度，简单易操作，宽的线性动力学范围，安全性好等优点，是目前体外诊断试剂检测方法中的佼佼者，在技术上具有明显的优势。
固相酶免疫测定方法在1971 年最初建立时称为酶联免疫吸附剂测定（Enzyme linked immunosorbent assay），简称ELISA 。ELISA 是一种敏感性高、特异性强、重复性好的实验诊断方法，由于其试剂稳定、易保存、操作简便、结果判断较客观等因素，以及既适宜于大规模筛查试验又可以用于少量标本的检测，既可以做定性试验也可以做定量分析等优点，已广泛应用于微生物学、寄生虫学、肿瘤学和细胞因子等领域。目前ELISA主要有双抗夹心、间接法、竞争法三类。竞争性ELISA法的基本原理是用酶标抗原与待测的非标记抗原竞争性的与固相载体上的限量抗体结合，待测抗原多，则形成非标记复合物多，酶标抗原与抗体结合就少，也就是酶标记复合物少，因此，显色程度与待测物含量成反比。 本实验拟用竞争性ELISA法对酒石酸美托洛尔抗原修饰后的聚联乙炔囊泡兔子血清多抗进行特异性免疫，通过囊泡颜色的变化程度与抗体浓度的关系选出最优浓度，绘制标准曲线，间接检测待测体系中美托洛尔的含量。
二、实验目的和意义
应用具有生物分子识别功能的联乙炔与半抗原偶联制得的聚联乙炔囊泡探针作为敏感元件，识别抗体后囊泡由蓝变红，同时产生荧光；样品中的待测物质与有限的抗体竞争结合，导致显色反应/荧光强度变弱，根据变色程度与待测药物浓度的负相关趋势，构建可视化免疫微阵列芯片，以快速、便捷、高通量监测血浆中的药物浓度，实现临床实时监控。
- 实验内容
1、PDA囊泡探针的制备
