肝素寡糖对c-jun过表达的HUVEC细胞的影响文献综述

 2022-12-22 19:55:49

开题报告内容:(包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述,不少于2000字)

  1. 课题研究背景及目的

本研究中肝素寡糖为实验室自制,采用亚硝酸裂解法裂解肝素、经Bio-gel P6分子筛层析分离纯化制得分子量为3200 D左右的肝素十二糖。本实验室前期研究发现肝素寡糖可以显著抑制bFGF诱导的HUVEC细胞体外管腔形成、增殖和迁移,机理研究表明肝素寡糖可以显著抑制靶点FGFR2的mRNA和蛋白表达水平,同时发现肝素寡糖也抑制转录因子c-Jun的mRNA和蛋白表达,通过生物信息学分析发现c-Jun存在和FGFR2启动子的结合位点。

本实验目的是验证肝素寡糖是否通过c-jun影响FGFR2蛋白的转录和表达。

  1. 研究内容及实验方案

为了验证肝素寡糖是否通过c-Jun影响FGFR2蛋白的转录,本研究通过构建pcDNA3.1( )/ c-Jun真核重组质粒并提取无内毒素质粒,将其转染进入HUVEC细胞后检测c-Jun和FGFR2的表达变化。

实验方案分为三部分:

  1. 同源重组法构建重组质粒pcDNA3.1( )/ c-Jun并提取无内毒素质粒;

通过反向PCR使得环状载体质粒pcDNA3.1( )线性化,以便外源目的基因的插入。在载体质粒上选择合适的克隆位点,尽量选择无重复序列且载体克隆位点上下游20 bp区域内GC含量在40%-60%的位点进行引物设计,PCR反应线性化载体。

在目的片段正反向扩增引物的5rsquo;端引入线性化载体质粒两个末端的长度为20 bp同源序列。首先通过NCBI系统查询c-Jun CDS区的完整序列,再在南京诺维赞生物科技有限公司提供的引物合成软件中分别输入相应载体克隆位点上游序列、载体克隆位点下游序列和插入片段完整序列,从而得到带有同源序列的目的片段引物,以10 ng/mL bFGF诱导HUVEC细胞模型组提取并逆转录得到的cDNA为模板,PCR扩增目的条带。

琼脂糖凝胶电泳对线性化载体和插入目的片段DNA含量进行估算,按照比例将重组体系混合好后于PCR仪中37℃保温30 min,后立即置于冰上冷却,得到重组质粒,转化进入DH5alpha;感受态细胞,氨苄青霉素抗性筛选得到阳性克隆,菌液PCR和质粒PCR鉴定后送去公司测序,保存重组质粒和菌种,按照无内毒素质粒小提试剂盒提取重组质粒pcDNA3.1( )/ c-Jun。

  1. 将质粒瞬时转染进入HUVEC细胞后给药处理;

将生长状态良好的HUVEC细胞铺进六孔板,在37℃培养箱继续培养若干小时。当细胞密度达到80%且状态良好时可以进行转染,实验组别设置为六组,分别为空白组(Control)、模型组(Model)、给药肝素寡糖实验组(0.01mu;M、0.1mu;M、1mu;M)以及对照组BGJ-398(0.5mu;M),除第一组空白组外,其余各组均转染c-Jun/pcDNA3.1( )重组质粒。转染24 h后按照细胞分组进行给药,继续放入培养箱培养24 h。取出孔板,收集细胞后进行后续的检测试验。

  1. 提取蛋白进行western blotting实验分析蛋白c-jun和FGFR2的表达。

将培养的细胞用冷0.01mol/L PBS漂洗后加入100micro;l RIPA裂解液,提取总蛋白,BCA法测定蛋白浓度并定量,经聚丙烯酰胺变性凝胶电泳分离蛋白,湿性电转法将蛋白转移到PVDF膜上,5%脱脂奶粉封闭,一抗抗体4℃孵育过夜,洗膜后辣根酶标记羊抗兔二抗室温孵育2h,化学发光法显影,曝光记录结果。

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