开题报告内容：
一．项目简介
Cct7基因所编码蛋白是分子伴侣TCP1(CCT)复合体家族的一员，这种复合体包含两种折叠序列，每种包含八个不同的蛋白质。未折叠的多肽进入此复合物的活性中心并以一种依赖于ATP的方式折叠成蛋白质。此复合物可以折叠成多种蛋白质包括肌动蛋白和微管蛋白，在真核细胞蛋白折叠中发挥重要作用，且在细胞质中高表达。关于cct7的报道文献较少，但确证其相关家族在癌细胞蛋白表达水平有显著差异。相关文献报道表明cct7基因转录物在众多癌组织包括乳腺癌中高表达，并且已用免疫组化方法证明了这种在蛋白质水平的变化，而其具体在癌症中的功能是未知的。本课题旨在研究cct7基因具体在乳腺癌中的作用和功能，研究其是否影响乳腺癌细胞的生长与迁移，首先构建含有cct7基因的克隆载体，其次选取具有代表性的三阴乳腺癌细胞系231和非三阴乳腺癌BT474细胞系，构建稳定过表达cct7质粒的乳腺癌细胞系，再次分别用MTS和Transwell 小室以检测cct7是否影响了乳腺癌细胞的生长与迁移。
，我们在一篇关于探究人类晚期结肠癌的蛋白质相互作用的文献中发现，cct家族的转录物在结肠癌中高表达，并且用免疫组化确证了这种在蛋白水平的变化，然而，蛋白质组学的研究却表明cct家族在癌组织中是下调的。另外，cct3和cct5通过微阵列分析被认为在诸如乳腺癌，肺癌等癌组织中有显著的差异表达，但其在癌症中的功能是未知的。
乳腺癌是一种起源于乳腺上皮组织的恶性肿瘤，为女性常见的恶性肿瘤之一女性乳腺是由皮肤、纤维组织、乳腺腺体和脂肪组成的。乳腺癌中99%发生在女性，男性仅占1%。乳腺并不是维持人体生命活动的重要器官，原位乳腺癌并不致命；但由于乳腺癌细胞丧失了正常细胞的特性，细胞之间连接松散，容易脱落。癌细胞一旦脱落，游离的癌细胞可以随血液或淋巴液播散全身，形成转移，危及生命。目前乳腺癌已成为威胁女性身心健康的常见肿瘤。全球乳腺癌发病率自20世纪70年代末开始一直呈上升趋势。美国8名妇女一生中就会有1人患乳腺癌。中国不是乳腺癌的高发国家，但不宜乐观，近年我国乳腺癌发病率的增长速度却高出高发国家1～2个百分点。据国家癌症中心和卫生部疾病预防控制局2012年公布的2009年乳腺癌发病数据显示：全国肿瘤登记地区乳腺癌发病率位居女性恶性肿瘤的第1位，女性乳腺癌发病率（粗率）全国合计为42.55/10万，城市为51.91/10万，农村为23.12/10万。近年来发病率有持续上升趋势,居女性恶性肿瘤发病率的前列。时至今日,乳腺癌的发生机制和病原预防研究仍然没有较大进展,其预后的优劣依然主要取决于病期早晚。其中，三阴乳腺癌是一类具有特殊生物学行为和临床病理特征，预后效果较差的特殊乳腺癌。癌组织免疫组织化学检查结果显示其雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和原癌基因Her-2均为阴性，临床表现为一种侵袭性病程，对内脏和脑的转移几率均较高。此实验我们选取三阴细胞系321和非三阴细胞系BT474为实验组，构建CCT7的克隆，设置阳性对照质粒PCHD-GFP，把它们分别稳定过表达入上述两种细胞系中，建成稳定过表达的cct7细胞系，初步通过荧光显微镜观察这四组细胞系的荧光，然后用流式细胞仪筛选带GFP荧光的细胞，扩大培养，此后分别做MTS和Transwell以检测该基因对乳腺癌的影响。
二．实验步骤
(一) 细胞培养
1.1 无菌操作
进入洁净区之前要换鞋和洁净服，要用酒精擦拭手部，戴手套。使用超净台前，要用酒精喷入吸水纸擦拭超净台，在此之外台面需紫外灯照射灭菌30分钟以上。同时，将实验所需材料外表喷洒酒精进行灭菌（血清、培养基、胰酶等）。使用时，关闭超净台的紫外灯，打开照明及风机，点燃酒精灯。每取用刻度移液管时，要注意在火焰上略烧，之后再安装上吸球使用。在打开培养瓶之前，可用酒精喷洒瓶盖，打开和重新盖上之前，瓶口都要在酒精灯上过火焰。
1. 2 细胞传代
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