金纳米荧光分子信标对活细胞中STAT5bmRNA的检测
1.研究背景
JAK-STAT信号转导通路(JAK-STATsignalingpathway)是与肿瘤发生发展关系最为密切的一类信号转导通路，在研究肿瘤分子靶向治疗、筛选分子药物靶标等方面具有重要意义。该通路由许多细胞因子和受体所激活，这些激活因子与细胞膜上受体相结合，使受体二聚化或多聚化。受体内源性酪氨酸蛋白激酶(proteintyrosinekinase,PTK)与相偶联的胞浆可溶性PTK迅速磷酸化，形成信号转导和转录激活因子(signaltransducersandactivatorsoftranscriptionSTATs)结合位点。最后,STATs通过SH2功能区与受体胞浆区结合后被激酶酪氨酸磷酸化，离开受体，形成二聚体并入核，进而结合于特定的DNA启动子序列，启动基因表达，调节细胞的分化、增生和凋亡。正常细胞中的STATs的磷酸化是短暂的，而肿瘤细胞自分泌或旁分泌的细胞因子以及基因改变所致的持续活化的酶类可致PTK的持续激活，从而使STATs呈现持续磷酸化。人类多种原发肿瘤和肿瘤细胞系都与JAK-STAT通路的异常表达和活化有重要关系。在此信号转导通路上,STATs蛋白家族是最重要的一类信号转导因子。迄今，研究人员在哺乳动物中发现7个STAT家族成员(Stat1~4,Stat5a,Stat5b和Stat6)。它们普遍存在于多种肿瘤细胞系和原发肿瘤中，通过JAK-STAT途径被活化从而参与肿瘤细胞的异常增殖、分化和血管生成等过程。在多种肿瘤细胞系和多种转化细胞系中(尤其是白血病和乳腺癌)，人类编码信号转导及转录活化因子5(signaltransducerandactivatoroftranscription5,STAT5)是STAT家族中与肿瘤最密切相关的成员。持续活化的STAT5增强了细胞的转化,同时也阻断了细胞的凋亡。目前对细胞内STATs蛋白的检测多用流式细胞术(flowcytometry,FCM)。也有用WesternBlot检测STAT蛋白的报道。但是WesternBlot样本的预处理步骤复杂、费时,对样本和试剂的消耗量大。同时,WesternBlot的结果由于条件所限，几乎只能做定性分析，而无法实现定量分析。而运用流式细胞术进行蛋白含量检测最大的缺点在于极易出现假阳性结果。同时，洗涤剂对细胞的破坏、标记时间长、操作步骤多,也是流式细胞术的限制因素。
2.研究主要内容
试验方法包括设计寡居核苷酸序列、制备金纳米粒、发卡型金纳米荧光分子信标的制备、稳定性实验、细胞毒性试验、激光共聚焦显微镜定性检测STAT5bmRNA表达、反转录PCR(RT-PCR)定量测定STAT5bmRNA表达。
2.1金纳米粒的制备
采用柠檬酸三钠还原法制备15nm金纳米粒。将合成过程中所有玻璃器皿用王水浸泡3h，再用超纯水涮洗3遍，放入70℃烘箱烘干备用。取2.2102mol/L氯金酸与25mL超纯水至三颈烧瓶中100℃油浴加热至沸腾,加入0.8mL2.5102mol/L柠檬酸三钠溶液，反应45min后自然冷却至室温，扫描紫外可见光谱并进行透射电子显微镜表征，后至于4℃冰箱保
存。
