开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
- 基于MDM2酸性结构域的新型p53调控剂的生物活性研究
一．文献综述
P53基因是一种肿瘤抑制基因。自从该基因在1979年被首次报道以来，有关研究论文在Medline上可查到20000余篇。在所有恶性肿瘤中，50%以上会出现该基因的突变，包括肝癌、乳腺癌、膀胱癌、胃癌、结肠癌、前列腺癌、软组织肉瘤、卵巢癌、脑瘤、淋巴细胞肿瘤、食道癌、肺癌、成骨肉瘤等。由这种基因编码的蛋白质是一种转录因子，其控制着细胞周期的启动。人们最初认为p53基因是一种癌基因，但随着近十年研究的深入,P53作为抑癌基因的功能逐渐被揭示出来。
P53 对于细胞周期的的调节功能主要体现在G1期进入S期和G2期进入M 期及退出M期的校正点的监测，与转录激活作用密切相关。P53下游基因P21编码蛋白是一个依赖细胞周期蛋白（cyclin）的蛋白激酶抑制剂，一方面P21 可与一系列细胞周期蛋白-周期蛋白依赖性激酶（cyclin-cdk） 复合物结合，抑制相应的蛋白激酶活性，导致Cyclin-cdk无法磷酸化视网膜胚细胞瘤蛋白(Rb) ，非磷酸化状态的Rb保持与E2F的结合，使E2F这一转录调节因子不能活化，引起G1期阻滞；另外P53的另外3个下游基因Cyclin B1,CADD45 和14-3-3sigma; 则参与G2/M期阻滞。 P53 下调Cyclin B1表达，细胞则不能进入M期CADD45通过抑制Cyclin B1-cdk2复合物的活性发挥作用，14-3-3sigma;与cdc25c结合，干扰Cyclin B1-cdk2复合物发挥转录调节作用。
P53对于细胞凋亡的作用是通过Bax/Bcl2 B淋巴细胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）, Fas/Apol(Fas/凋亡蛋白)，IGFBP-3（胰岛素样生长因子结合蛋白3，insulin-like growth factor binding 3, IGFBP-3） 等蛋白完成的。Bcl-2 可阻止凋亡形成因子如细胞色素C等从线粒体释放出来，具有抗凋亡作用，而Bax可与线粒体上的电压依赖性离子通道相互作用，介导细胞色素c 的释放，具有凋亡作用，p53可以上调Bax的表达水平，以及下调Bcl-2的表达共同完成促进细胞凋亡作用。P53还可通过死亡信号受体蛋白途径诱导凋亡，TNF（肿瘤坏死因子） 受体和Fas蛋白。有学者认为P53 还可直接刺激线粒体释放高毒性的氧自由基来引发凋亡。
在Mdm2/MdmX-p53途径中，Mdm2(鼠双微染色体2，murine double minute 2,又称为Hdm2)作为p53的下游靶基因，通过两种机制调节p53。首先N-Mdm2(Mdm2的N端p53结合域)与p53 TAD区域(transferring activating domain,转录激活结构域)结合阻碍p53的转录激活；其次Mdm2作为E3泛素化酶，可以介导p53的泛素化降解及其空间定位。MdmX(鼠双微染色体X，murine double minute X,又称为Hdm4)也可以通过其N端的p53结合域(Mdm2的同源域)与p53相互作用。MdmX可以作为Mdm2的泛素化靶蛋白被降解，也可以与Mdm2形成异源二聚体Mdm2/MdmX复合物(这与两者的锌指结构域有关，构成了p53泛素化的重要的E3连接酶)。Mdm2/MdmX-p53途径在一些USP(泛素特异性蛋白酶，ubiquitin specific protease)家族去泛素化酶(deubiquitinating enzymes,DUBs)作用下，可以稳定这三种蛋白质，通过去泛素化的差异性，使调节更为精确。不仅如此， p53能够诱导产生它的负调控因子Mdm2。在转录修饰水平上，因为p53结合区域丢失也就丧失了对p53的调控，因此，为应对细胞压力，细胞会产生Mdm2和MdmX的相关剪切异构体，如Mdm2-ALT1和MdmX-ALT2。在翻译后修饰水平，相应伴随着p53的脱乙酰化及去磷酸化作用，可维持Mdm2/MdmX-p53的动态平衡[4]。肿瘤的发生与这种平衡的破坏密切相关，因此，针对Mdm2、MdmX 在N端的p53结合域的分子抑制剂的研发早已成为肿瘤药物开发的热门。
二．研究的问题及方法
本实验着重对已有的具有潜在调控p53 ,p21及Mdm2蛋白活性的化合物进行生物活性的分析，从而初步筛选具有成药性的化合物。通过SDS聚丙烯酰氨凝胶电泳分离细胞蛋白和抗原-抗体杂交曝光对正常上皮细胞给药前后目的蛋白表达的变化的情况，初步判断化合物是否具有生物学活性。本实验主要研究手段即western blot。
- 抗体的选择：通过市场调研和他人介绍，进口抗体一般不会出现闪失：abcam品种全，质量过硬，但价高（3400元/100微升），而且说是100微升，但至多能吸出来90微升；Sigma的价最贵；比较有性价比的是CST的抗体，现在大约是2200元/100微升， 1:1000的稀释比下，基本可以做出很明显的条带，100微升通常能完成所有的免疫组化和western blot实验，还有一个优点是通常量比100微升多出来10微升，唯一的不足是CST的品种实在不多。Santa的多克隆抗体质量可以，但是选用Santa的单抗还是有风险。Millipore的抗体价格便宜而且效价很棒（1:10000都可以做出很明显的条带）。CST的抗体在多篇文献中反复使用，而且这个品牌是做磷酸化蛋白抗体最好的公司。因此，P21和P53最终选择了CST的而二抗和相对比较容易杂交出条带的MDM2和特异性不需要太高的二抗选择了经济便宜的millipore。
- Western blot仪器的选择：目前最好的垂直槽和转移槽还是Biorad（伯乐），尤其是MINI3好用,MINI4可以一次跑四块胶，但通常用不上，由此造成垂直缓冲液的浪费，而且MINI4用绿色塑料夹住玻璃板来组成内槽，容易漏液，塑料夹应该是有疲劳寿命的，随着使用次数的增加，弹性就会改变。但是伯乐的一套系统得两万多。因此在实验中需要格外爱护。北京六一的垂直槽很转移槽很好用，但垂直槽配胶不方便，玻板太厚，散热不好。但是，六一的电泳仪（电源）还是很好用的。 因此实验室选择了伯乐的电泳槽和玻璃板，而电源选择了六一的电源。
- 内参的选择：通常情况下，在Western blot中 beta-actin(细胞骨架蛋白)，Tubulin(微管蛋白)，GAPDH（3-磷酸甘油醛脱氢酶）都可以作为内参，因为实验室里有现成1:10000稀释的beta-actin的抗体，因此初步选择beta-actin作为内参基因。而且，在一些对糖代谢有干预作用的实验中，GAPDH的表达会改变，因此在那些实验中，GAPDH并不能作为内参。
- 封闭液，显影定影条件的选择：光明的脱脂奶粉，奶粉质量不好，会最终导致显影要么漆黑一片，要么啥都没。fluka的很好，可惜因为疯牛病的原因，现在海关禁止进口美国牛制品。最终选择Sudgen的脱脂奶粉，很好很稳定，如果回收使用，250克可以用很长时间。细菌达到一定极限后，会导致TBST里的奶粉变质，表现为发绿发臭，鼻子凑过去能嗅出的臭，这时候就需要更换了。nc膜，pvdf膜在western中都可以使用。最终选择 pvdf膜，它的好处是蛋白载量大，韧性好。唯一的麻烦是事先得用甲醇泡几分钟，目的是为了增强膜的正电荷。显影液选择的是Tanon的显影液，与曝光机器匹配。
- Western blot 的实验条件：Western Blot实验条件基本按照按ABCAM公司经典教材做，网址如下：（http://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/WB-beginner.pdf）。
转膜实验设定是通常是快转两百200毫安/2小时（通常是1kDa/min），慢转80毫安/12小时。快转过程需要冰水浴，否则在转膜过程中会放出大量的热量从而使目标蛋白变质分解。
要强调的是垂直电泳缓冲液千万不能回收反复用，反复使用次数多了会导致你的电泳速度变慢，最后跑出来的胶也不好看。转膜液可重复利用两次。
