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开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字） 一、研究背景 肿瘤多药耐药（MDR）是指肿瘤细胞或者微生物对多种结构和机理不相关的药物产生的获得性耐药。这种多药耐药的发生已经成为癌症化疗失败的主要原因之一[1]。 研究发现产生MDR最根本的原因是镶嵌于细胞膜上多种ATP结合盒家族的转运蛋白同时过度表达，这种转运蛋白可以将药物从胞内泵出，造成胞内药物浓度降低，从而导致化疗失败[2,3]。ABC（ATP-binding cassette subfamily）跨膜转运蛋白的过度表达是MDR产生的最主要原因之一，这些蛋白包括：P-糖蛋白（P-gp, ABCB1），胸腺肿瘤细胞耐药蛋白(BCRP, ABCG2)和多药耐药相关蛋白（1MRP1, ABCC）。其中，P-糖蛋白是ABC转运蛋白超家族中第一个被发现，也是目前研究最为广泛的ABC转运蛋白。 肿瘤多药耐药逆转剂作用机制复杂，种类繁多，发展迅速，已发展到第三代。 第 一代逆转剂主要来源于临床，包括环孢素、维拉帕米、奎尼丁等，该类抑制剂尽管有一定的p-gp抑制效果，但同时也存在明显的药物毒性，限制其临床使用[4，5]; 第二代逆转剂是对第 1代逆转剂进行结构改造而合成，主要包括右维拉帕米、环孢素的同系物和哌啶类衍生物等，该类抑制剂对p-糖蛋白的抑制活性得到了明显的提高，但同时也存在其他不良反应[6]；第3 代MDR逆转剂包括: 新型氨基哌啶类逆转剂S9788， 吖叮酮酸酰胺衍生物GF120918, 环丙基二苯并环庚烷类物质Laniquidar及四氢一喹啉累物质Tariquidar等，该类抑制剂基本克服了第一代、第二代的缺点和不足，已成为最新的研究热点[7]。但最具潜力的MDR逆转剂Tariquidar的研究终止于III期临床，原因为IIb期临床中发现其与一线化疗药物连用时，比安慰剂组毒性大，同时IIb期对乳腺癌治疗效果不佳[8]。 本课题主要以第三代肿瘤多药耐药逆转剂Tariquidar为先导化合物，进行结构优化，设计合成一系列化合物并对所合化合物进行生物评估，目的是开发新型高效低毒的肿瘤多药耐药逆转剂。 二、 课题设计 1.Tairiqudar的构效关系 近年来，研究者对第三代P-gp 抑制剂中的邻氨基苯甲酰胺类化合物进行了大量的构效关系研究，并以构效关系为基础设计合成了新的第三代P-gp 抑制剂，如韩美公司开发的已进入Ⅲ期临床研究的HM30181[9]和波恩大学研究的尚处于临床前研究阶段的WK-X-34[10]。 以tariquidar 结构为代表，邻氨基苯甲酰胺类P-gp 抑制剂结构中对药理活性有重要影响的基团有 [8,11,12]：1、喹啉环中的N 原子作为氢键受体与P-gp 相互作用；2、邻氨基苯甲酰胺母核上的硝基、二甲氨基或氟原子等吸电子基团会使活性下降；3、甲氧基作为氢键受体存在与四氢异喹啉环上，对于化合物的P-gp抑制活性起到关键作用。另外，当以其他芳香环取代喹啉环时，P-gp 抑制活性降低而BCRP抑制活性增加。
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2．化合物设计思路
以Tariquidar和WK-X-34 为代表的四氢异喹啉乙基苯胺类第三代P-gp抑制剂结构中含有多个疏水芳香环，因此，这类化合物存在分子量较大等不利于成药的缺点。通过结构简化，去掉左侧苯环上的3,4-二甲氧基，如上图绿色圆圈所示，其次利用骨架跃迁的方法，将苯基胺甲酰替换为N-甲基-1,2,3-三氮唑，作为新的电子受体，得到三氮唑四氢异喹啉类P-gp抑制剂。
3.预计化合物合成路线：
Reagents and conditions: (i) 3-bromoprop-1-yne, K2CO3, acetone, reflux, 4 h; (ii)NaOH，80%MeOH; (iii)RNH2, EDCI/DMAP,DCM r.t., 5h; (iv) NaN3, water, 80℃, 24 h; (v) TEA/DCM, TsCl, r.t., 24h; (vi)Paraformaldehyde，EtOH，HCl，reflux 5h， (vii) TEA/acetonitrile, 60℃, 24h; (viii) g, ascorbate sodium, CuSO4, 75% CH3OH, 2448 h.
不同取代基取代的化合物合成中可能出现问题，需适当改变合成条件，调整合成路线。
4.化合物生物活性评估：
待测化合物的生物活性评估主要进行一下三个实验：
4.1 化合物细胞毒试验：
实验目的：主要测定化合物对K562细胞（人白血病细胞株）和K562/A02细胞（阿霉素耐药的人白血病细胞，P-gp高表达）产生的细胞毒性。
实验方法：取对数期的K562和K562/A02细胞，以6104个/ml 密度接种于96孔板中，培养24h，目标药物稀释加入孔中，阳性对照组给予阿霉素，空白对照组给予等体积的0.1%DMSO。培养箱保持37℃，5%CO2，无菌培养48h。而后每孔加入20mu;lMTT（5mg/ml），再培养4h，酶标仪上读出490nm处的OD值。计算化合物对细胞的抑制率，并用GraphPad Prism 5.0 软件中的量效曲线计算化合物的IC50值。
4.2 化合物你转肿瘤细胞MDR活性试验：
实验目的：测试目标化合物对P-糖蛋白介导的肿瘤多药耐药逆转活性；
实验方法：取对数生长期K562/A02细胞于96孔板中，培养箱保持37℃，95%空气，5%二氧化碳培养，设定空白对照组、受试化合物组、阳性对照组，加入MTT，培养48h，离心，弃去培养液，加入DMSO溶解，酶标仪上于波长490nm处读取光密度，计算化合物对细胞的抑制率，以GraphPad Prism 5.0 软件中的量效曲线计算抗肿瘤药物阿霉素的IC50值，并计算逆转倍数（RF）。细胞抑制率＝1-（试验组OD平均值/对照组OD平均值）100%
逆转倍数（RF）= IC50A/IC50B
其中IC50A为阿霉素对K562/A02的IC50，IC50B为加入待测化合物后阿霉素对K562/A02的IC50。
4.3 ADM（阿霉素）积累试验：
实验目的：测试目标化合物使得抗肿瘤药物在肿瘤细胞中积累量，从而证明其逆转肿瘤多药耐药活性大小。
实验方法：取对数生长期K562/A02细胞于96孔板中，加入待细胞长满后，用排枪吸去培养基，每孔加入不含血清的1640培养基160mu;L，37 C 孵育30min，每空加入阿霉素，然后分别加入不同浓度的待测化合物和阳性对照维拉帕米，相同体积的0.1% DMSO，37℃孵育150min后，用冰PBS将细胞洗涤两次，裂解液（0.75 M HCl, 0.2% Triton-X100 异丙醇溶液）裂解细胞，避光、4℃保存。荧光分光光度法（激发波长Ex=460nm，发射波长Em=610nm）测定各孔荧光强度，实验重复2次。
参考文献：
[1] PAUWELS E K, ERBA P, MARIANI G, et al. Multidrug resistance in cancer: its mechanism and its modulation [J]. Drug News Perspect, 2007, 20(6): 371-377.
[2] [17] CHEN Z, SHI T, ZHANG L, et al. Mammalian drug efflux transporters of the ATP binding cassette (ABC) family in multidrug resistance: A review of the past decade [J]. Cancer letters, 2016, 370(1): 153-164.
[6] KESSLER D A, AUSTIN R H, LEVINE H. Resistance to chemotherapy: patient variability and cellular heterogeneity [J]. Cancer research, 2014, 74(17): 4663-4670.
[4] FERRY D R, TRAUNECKER H, KERR D J. Clinical trials of P-glycoprotein reversal in solid tumours [J]. European Journal of Cancer, 1996, 32(6): 1070-1081.
[5] RAMAKRISHNAN P. The role of P-glycoprotein in the blood-brain barrier [J]. Einstein Quart. J. Biol. Med, 2003, 19: 160-165.
[6] HENNESSY M, SPIERS J P. A primer on the mechanics of P-glycoprotein the multidrug transporter [J]. Pharmacological research, 2007, 55(1): 1-15.
[7] DANTZIG A H, SHEPARD R L, CAO J, et al. Reversal of P-glycoprotein-mediated multidrug resistance by a potent cyclopropyldibenzosuberane modulator, LY335979 [J]. Cancer Research, 1996, 56(18): 4171-4179.
[8] PALMEIRA A, SOUSA E, H VASCONCELOS M, et al. Three decades of P-gp inhibitors: skimming through several generations and scaffolds [J]. Current medicinal chemistry, 2012, 19(13): 1946-2025.
[9] KIM T E, GU N, YOON S H, et al. Tolerability and pharmacokinetics of a new P-glycoprotein inhibitor, HM30181, in healthy Korean male volunteers: single-and multiple-dose randomized, placebo-controlled studies [J]. Clinical therapeutics, 2012, 34(2): 482-494.
[10] JEKERLE V, KLINKHAMMER W, REILLY R M, et al. Novel tetrahydroisoquinolin-ethyl-
phenylamine based multidrug resistance inhibitors with broad-spectrum modulating properties [J]. Cancer chemotherapy and pharmacology, 2007, 59(1): 61-69.
[11] PAJEVA I K, WIESE M. Structureactivity relationships of tariquidar analogs as multidrug resistance modulators [J]. The AAPS journal, 2009, 11(3): 435-444.
[12] GLOBISCH C, PAJEVA I K, WIESE M. Structureactivity relationships of a series of tariquidar analogs as multidrug resistance modulators [J]. Bioorganic medicinal chemistry, 2006, 14(5): 1588-1598.
