课题名称：大黄酸诱导人正常肝细胞凋亡及其机制研究
1、课题研究的目的和意义
肝脏是各种营养物质以及毒物在体内代谢的最主要场所,是机体最容易遭受到损伤的脏器之一。由于各种不良的生活习惯和各种药物的大量使用,使肝病已经成为严重的健康问题,深入研究其发生、发展的机制,将会对肝损伤的预防和治疗起到很大的积极促进作用。现今，药物引起的肝脏损伤备受人们关注，何首乌作为一种中药材广泛应用于临床治疗，有着确信的抗肿瘤活性。何首乌中的活性成分能够引起癌细胞的凋亡，是其抗肿瘤作用的原理。但在多年的临床应用中，在对病人使用何首乌治疗后经常会出现不同程度的肝脏损伤，而这些相关药物引起的肝脏损伤的报告也在不断增加。所以我们做出这样的假设：何首乌可以通过引起癌细胞的凋亡来治疗肿瘤，那在治疗肿瘤的同时也会对正常的细胞也产生与癌细胞相同的药理活性，即何首乌也会引起正常细胞，尤其是肝脏细胞的凋亡，从而引起病人肝脏的损伤。何首乌、大黄等蓼科植物中的活性成分，主要是蒽醌类，有大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄酸甲醚、芦荟大黄素。大黄酸是何首乌蒽醌类物质中抗肿瘤活性是研究最多的方面之一，本文选取大黄酸作为实验对象，探讨大黄酸是否也能够引起人正常肝细胞的凋亡并初步探讨其诱导凋亡机制，从这个角度初步阐明相关药物引起肝脏损伤的共同毒理机制。
大黄酸能够诱导肝癌细胞HepG2的凋亡，表现出抗肿瘤活性。细胞凋亡主要存在两条通路:线粒体通路和死亡受体通路。线粒体通路由含BH3结构域的Bcl-2家族成员Bid、Bad等在接受到胞内的死亡信号后激活。Bad与结合在线粒体外膜面或存在于胞浆的Bcl-2成员Bax、Bak等相互作用,导致后者的寡聚并插入线粒体膜,引起线粒体膜通透性改变,跨膜电位丢失, 主要存在于线粒体内部的Cytochrome c (Cyt c）就从线粒体中逸出。当Cyt c进入细胞胞浆中，释放出。释放后的Cyt c与凋亡蛋白酶活化因子(apoptotic protease -activatingfactor-1,Apaf-1)和procaspase -9形成多聚复合体, 当procaspase-9聚集要一定数目时，相互之间会产激活，并使其自我剪切活化成为caspase-9，并启动caspase级联反应，进而激活下游的caspase -3，完成其相应底物的剪切，产生一系列的细胞凋亡程序，最终导致整个细胞的凋亡。
2、主要实验内容
1.细胞培养
选用人正常肝脏细胞L02细胞进行体外培养。
2.MTT染色
四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)由Mosmanm在1983年首创,其原理是活细胞内的线粒体琥珀酸脱氢酶可将MTT还原成紫蓝色的结晶物, 在一定范围内, 该有色物质的量与细胞数成正比,采用酶标仪在490 nm处测其吸光值可间接反映活细胞的数量。
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