一、实验背景钙离子对细胞的生理功能具有多种调节作用，可促进细胞的生长、增殖以及凋亡等。
瞬时受体电位（transient receptor potential, TRP）通道家族分为七大类，其中TRPC在肾脏，平滑肌，神经系统等许多组织均有表达。
特异性TRPC通道小分子调节剂对于研究TRPC通道的作用特点具有十分重要的意义。
二、实验目的熟练掌握TRPC5通道激动剂、抑制剂的筛选方法，学习如何从天然来源小分子中筛选得到TRPC5配体；通过实验了解TRPC5激动剂Englerin A和TRPC5抑制剂Pico145的浓度依赖性激动或抑制TRPC5通道的能力，并掌握作图、表格绘制软件的使用；通过使用TRPC5通道激动剂Englerin A (EA)、抑制剂Pico145作为阳性对照，验证基于Fluo-4 AM荧光染料检测化合物对TRPC5-HEK 293调节活性的细胞模型的稳定性。
三、实验内容TRPC5稳转细胞系复苏→细胞传代→验证Englerin A和Pico145针对TRPC5的浓效关系→不同化合物调控TRPC5引起钙内流情况。
1、细胞复苏冻存管从液氮中取出→37℃水浴锅手动加热融化→快速转移到复苏液（9 ml DMEM 100 mu;L HE PS）→混匀离心（800 rpm,3-5 min）→吸弃上清液，加入培养液→吹打→转移到培养瓶中，标记，培养→过夜观察。
2、细胞传代依次过滤PBS、胰酶、培养液→吸弃旧培养液并用PBS清洗→加入适量消化液→显微镜下观察至细胞胞质回缩，细胞之间不再连接成片→吸弃消化液加入新培养液→吹打成细胞悬液→离心（1000r，8min）→弃上清液加入新培养液→吹打制成细胞悬液→分装2-3个培养瓶→标记→培养。
3、验证Englerin A和Pico145针对TRPC5的浓效关系，构建TRPC5-HEK 293钙通透性模型 （1）不同浓度Englerin A TRPC5稳转细胞系/HEK 293→FLIPR检测，计算EC50（2）Englerin A 不同浓度Pico145 TRPC5稳转细胞系/HEK 293→FLIPR检测，计算IC50（3）选取合适浓度Englerin A、Pico145构建TRPC5-HEK 293化合物筛选模型。
4、测定不同化合物调控TRPC5引起钙内流情况。
