开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
一．研究背景（文献综述）
糖基化是自然界次级代谢产物的一种重要结构后修饰反应，是由糖基转移酶以糖基供体和受体(亲核物质)为底物，把糖基供体转移到受体上的过程。特定的受体分子包括蛋白、核酸、寡糖、脂和其他小分子物质，糖基供体是核苷二磷酸活化形式(NDP-)的各种糖基，主要是一些NDP-六碳糖，其中UDP-葡萄糖最为常见；另外还包括一些NDP-脱氧六碳糖以及许多稀有的NDP-糖胺等[1]。糖基对天然产物的生理活性、特异性以及药理活性都有至关重要的作用[2]，例如芒果苷具有抗糖尿病的作用、芦丁可以改善心血管疾病等。大部分天然产物的糖基化是O-糖基化，很容易在体内自发地或在酶的催化作用下水解而失去或降低活性。而作为另一种糖基化形式，C-糖苷类化合物不仅具有O-糖苷类物质的药理活性和疗效，而且其糖苷键稳定不易断裂[3]。例如，根皮素3-C-糖苷化合物（nothofagin）比根皮素2-O-糖苷化合物（根皮苷）在治疗Ⅱ型糖尿病时对葡萄糖-钠共转运体2（SGLT2）具有更高的选择性和更稳定的抑制活性[4]。然而，天然C-糖苷类化合物在自然界中十分罕见[5]，因此发现或合成具有药理活性的C-糖苷化合物，一直是科学家们研究的重点。
Nothofagin是来源于南非植物Rooibos（Aspalathus linearis）[6]（博士茶）中的3-C-葡萄糖化二氢查耳酮，目前仅在少数植物中分离得到该化合物（除了rooibos外，还在铁青树科的华南青皮木[7]中发现该种化合物）。Nothofagin具有较好的药理活性，Wonhwa Lee等人[8]发现来自Rooibos（Aspalathus linearis）的nothofagin（Not）对HMGB1诱导的体外和体内的脓毒症反应具有很好的改善作用；并且实验结果表明， Not通过抑制HGMB1的信号通路有潜力成为治疗严重血管炎性疾病的药物，也是治疗白血病的新策略。Jong-Sup Bae[9]等人通过研究Not体内外的抗炎活性，发现Not具有抗炎功能，可以抑制高渗透性，CAM（细胞粘附分子）的表达，以及白细胞的粘附和迁移，从而可能是治疗由脂多糖调节引起的血管炎性疾病的一种新疗法。Sae-Kwang Ku[10]等人发现Not可以抑制体内外高葡萄糖所引起的炎症，经过实验验证，结果表明Not的治疗是通过抑制原发性人内皮细胞内的NF-kappa;B来阻断HG诱导的血管炎症，并且表明Not对糖尿病并发症和动脉粥样硬化有显着的治疗作用，可以作为用于治疗糖尿病血管炎性疾病的候选药物。Lindie Schloms[11]等人发现rooibos中的黄酮类成分具有抑制关键肾上腺素类固醇激酶的活性，并可以调控H295R细胞中类固醇激素的水平，又进一步发现所有的黄酮类化合物在肾上腺类固醇类激素生成中都具有抑制CYP17A1和 3beta;HSD2，以及分支点酶的活性，二氢查耳酮还具有抑制CYP21A2的活性。Ana R. Jesus和 Diogo Vila-Viçosa等人[4]证实nothofagin可以抑制葡萄糖-钠共转运体2（SGLT2），减少肾中葡萄糖的重吸收从而降低Ⅱ型糖尿病病人血糖水平，其中IC5011.9nM很好地体现了nothofagin对Ⅱ型糖尿病的治疗作用。除此之外，由于nothofagin的C-C苷键的代谢稳定性[12]，使得它可以被人体以完整糖苷的形式吸收，从而更有效持续地发挥药理作用。
但天然nothofagin的资源有限，于是科学家们尝试利用化学和生物的方法合成该化合物。Minehan [13][14]等人进行了nothofagin的全合成，三苄基葡萄糖、三苄基间苯三酚、4-（苄氧基）苯基乙炔参与反应，八步合成nothofagin 的产率是28%。Amélia P. Rauter[4]等人从酰基间苯三酚的C-葡糖基化开始，然后进行苄基化，醛醇缩合和脱保护，制备nothofagin，12h的四步合成的产率仅为21％，但这种合成途径可以被认为是Minehan等人的复合八步合成的改进。化学方法合成nothofagin需要进行官能团的保护与脱保护，此外还需要考虑糖基化的位置和立体选择性的问题。酶法催化合成nothofagin也有相应的报道，Linda Bungaruang等 [15]以根皮素为底物，添加OsCGT（Oryza sativa(rice)）和UDP-葡萄糖催化生成目标产物nothofagin，UDP-葡萄糖是蔗糖在蔗糖合酶的作用下与UDP反应生成，作为糖供体参与到nothofagin的合成中。另外，Alexander Gutmann[16]等人利用O-糖苷和C-糖苷之间的重排进行nothofagin的合成，利用PcOGT催化O-糖基化反应的可逆性使根皮苷和UDP作用生成UDP-葡萄糖和根皮素，而UDP-葡萄糖和根皮素在OsCGT作用下则可以生成nothofagin，产率大于80%。另外，OsCGT突变体I121D催化生成nothofagin的产率大于70%，但反应过程中除了3-C-糖苷产物外，还有4-O-糖苷产物的生成。现有关于生物合成nothofagin的反应中，常需添加昂贵的UDP-葡萄糖，而双酶法催化反应还伴有副产物的生成。因此发掘具有底物杂泛性的新型C-糖基转移酶，不仅能丰富C-糖基转移酶的种类，而且还可为结构新颖多样的活性C-糖苷类化合物的高效、可设计性定向合成提供全新的方法。从芒果Mangifera indica叶中发现的C-糖基转移酶MiCGTb，对结构多样的酰基间苯三酚葡萄糖苷具有去2-O-糖基化和3-C-糖基化活性，也是第一次使用单C-糖基转移酶通过脱-O-葡糖基化和C-葡糖基化偶联高效合成3-C-葡萄糖苷[17]。
综上所述，通过构建C-糖基转移酶MiCGTb工程菌表达系统，催化根皮苷生成nothofagin，利用该酶的脱-O-糖基化与C-糖基化的特性，使用根皮苷分子中的葡萄糖，不必额外投入昂贵的供体底物UDP-葡萄糖，从而开发一条经济环保、绿色高效的合成活性C-糖苷类化合物的新途径，
二．研究目的和意义
1.进一步评价MiCGTb作为工具酶应用的优势，为之后C-糖苷类化合物的合成提供参考依据。
2.研究采用单酶法，在反应体系中无需添加昂贵的糖基供体UDP-葡萄糖的情况下，成功获得了C-糖基化产物，是一条绿色环保、经济的合成途径。
3.使用纯酶和构建工程菌BL21进行酶促放大反应，实现天然产物nothofagin的高效生产。
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