一、研究内容
1、Keap1-Nrf2-ARE通路与氧化应激
Keap1-Nrf2-ARE信号通路是细胞中氧化应激的关键通路，是细胞防御系统的重要组成部分。
抗氧化反应元件ARE(antioxidant response element, 5-GTGACnnnGC-3)能介导超过 100个抗氧化基因的转录和抗氧化蛋白的表达，包括I相和II相解毒酶、转运蛋白、伴侣分子等1。在该信号通路中，ARE 与入核的转录因子 Nrf2 结合，受其调控。同时，细胞中游离的 Nrf2 的含量又主要受Keap1调控。
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图 1 Nrf2蛋白结构域 |
人源Nrf2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2）由605个氨基酸组成，其分子量为66kDa，是CNC(Cap-N-Collar) 转录因子家族的一员2。其拥有6个高度保守的结构域，分别为Neh1-Neh63。Neh1结构域为亮氨酸拉链bZIP结构，该结构域能与小Maf家族蛋白形成异源二聚体后结合DNA，从而完成Nrf2的细胞核定位，进而激活相关基因转录4。Neh2结构域主要功能为通过DLG和ETGE序列与Keap1同源二聚体结合，形成Keap1-Nrf2复合物，包含2个Keap1结合位点5。Neh3结构域含有介导ARE基因转录必要的CNC bZIP结构。Neh4和Neh5结构域与基因转录有关6。Neh6结构域具有丰富的丝氨酸序列，可受氧化物刺激激活Nrf2。
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图 2 Keap1蛋白结构域 |
Keap1(Kelch-like ECH-associated protein-1)由625个氨基酸组成，其分子量为69.7KDa，是一种肌动蛋白结合蛋白。其包含5个结构域：（1）N端结构域（NTR）；（2）BTB 结构域（Broad complex, Tramtrack, and Bric-a-Brac）；（3）IVR结构域（the linker intervening region）；（4）Kelch结构域；（5）C端结构域。其中BTB结构域涉及Keap1的同源二聚化和与Cul3-E3泛素连接酶形成复合物7。IVR结构域富含半胱氨酸，是发挥功能的主要部位，其可以感受细胞内氧和核输出信号。Kelch 结构域由6个重复的Kelch序列组成了六叶beta;构象，是与Nrf2上Neh2结构域结合形成复合物的区域8。
在正常生理条件下，Keap1通过自身的BTB结构域形成同源二聚体，该二聚体又通过Kelch结构域与Nrf2的Neh2结构域结合。同时，Keap1作为接头蛋白，与Cul3-E3泛素连接酶形成复合物，介导Nrf2被蛋白酶体降解，保持Nrf2以较低的浓度存在。当受到内源性或外源性的氧化和亲电物质刺激时，Keap1上BTB结构域中的半胱氨酸被共价修饰，导致Keap1不能结合Cul3，泛素降解被阻断，Nrf2在细胞中蓄积9。最终导致Keap1-Nrf2解聚，Nrf2被激活入核，引发相关基因转录表达。
2、Keap1-Nrf2-ARE通路相关疾病
亲电物质和氧化剂虽是人体经常遇到的化学刺激，但会给细胞造成巨大伤害10。在细胞的应激调控系统中，Keap1-Nrf2-ARE信号通路发挥着至关重要的作用。若缺失Nrf2，会加剧细胞氧化和炎症损伤，引发众多炎症相关疾病，例如，癌症、阿尔兹海默、帕金森、慢性阻塞性肺部疾病、哮喘、动脉粥样硬化、糖尿病、多发性硬化症、骨关节炎以及类风湿性关节炎等11 12。若Nrf2过量，则一定程度会增强肿瘤细胞的耐药性。故针对不同疾病，开发相应的Nrf2调节剂。
3、Keap1-Nrf2-ARE通路激活剂
目前Keap1-Nrf2-ARE通路激活剂的作用方式可以分为2类：（1）共价修饰半胱氨酸残基；（2）干扰Keap1-Cul3或Keap1-Nrf2的蛋白-蛋白相互作用。后者的作用方式中，由于Keap1和Cul3作用方式不明确，所以干扰Keap1-Nrf2的蛋白-蛋白相互作用居多。
在正常生理条件下，Keap1被氧化物或亲电物质以共价修饰其半胱氨酸残基的形式激活，从而激活整条信号通路。研究人员模仿该激活模式，开发了一系列具有亲电基团的Nrf2激动剂，可分为直接激活剂和代谢激活剂。直接激活剂中，迈克尔受体类激活剂是最具代表的一类激活剂，其研究最为广泛和深入。该类化合物低浓度时有利于激活Nrf2，但在高浓度时，其选择性较差，易发生脱靶效应，产生毒副作用13。代谢激活剂的代表是多酚类化合物，其先在细胞内氧化成亲电性的醌，再通过迈克尔受体的方式激活Nrf2 14。
作用于Keap1-Nrf2的蛋白-蛋白相互作用的Nrf2激活剂可以分为多肽类和小分子类激活剂。但是多肽类抑制剂存在稳定性差，透膜性差，成本高等缺陷，限制了多肽抑制剂的应用。与多肽相比，小分子抑制剂具有成本较低，稳定性好和口服生物利用度高等成药性优势，因此成为了 Keap1-Nrf2 PPI 抑制剂开发的又一重要方向。
二、研究目的
由于亲电型Nrf2激动剂的共价结合机制，使其缺乏选择性和具有毒副作用。因此，通过可逆竞争地结合Keap1，抑制Keap1-Nrf2的蛋白-蛋白相互作用而激活Nrf2可有效的避免共价结合方式导致的安全性问题。故本项目的研究目的是开发靶向性较明确，不易造成脱靶效应且理化性质较好的Keap1-Nrf2蛋白-蛋白相互作用小分子抑制剂，实现安全而有效调控Keap1-Nrf2-ARE通路。
三、前期工作
调控Keap1-Nrf2蛋白-蛋白相互作用，深入研究其动态作用模式是关键。在课题组前期的工作中，通过分子动力学模拟的手段模拟了Keap1-Nrf2的动态作用过程，结合氢键分析、结合能计算和能量分解等手段，我们发现Nrf2的关键谷氨酸残基Glu79和Glu82在Keap1-Nrf2的识别和结合中起到关键作用。Glu79和Glu82参与的极性相互作用是Keap1-Nrf2相互识别结合的关键。为高效发现高活性Keap1-Nrf2抑制剂奠定了基础。根据分子动力学模拟得到的结果，通过模拟天然谷氨酸残基的侧链在Cpd16上引入两个乙酸支链得到Compound 2，实现了对P1和P2亚口袋的有效占据，实现了对Keap1的强结合，成功设计了新型高效Keap1-Nrf2抑制剂。与Keap1的KD值从原先的1690 nM下降到9.91 nM，首次将小分子Keap1-Nrf2抑制剂的亲和力提高到低纳摩尔级别，是目前活性最强的Keap1-Nrf2小分子抑制剂15。荧光偏振的实验表明其抑制Keap1-Nrf2相互作用的EC50为28.6 nM。基于此部分的研究，我们已经初步建立了高效发现PPI抑制剂的研究思路和技术路线，并运用这些思路和技术首次成功发现低纳摩尔级的Keap1-Nrf2抑制剂。这些研究成果为PPI抑制剂发现的方法学研究提供了良好基础。然而，Compound 2虽具有优异活性，但该化合物分子极性表面积较大，脂溶性较差，极大地影响其透膜性，限制其应用。
图 3基于结合关键特征合理设计Keap1-Nrf2蛋白-蛋白相互作用抑制剂
综上所述，本课题以Keap1的蛋白作用网络为起始，对Keap1底物识别和结合机制进行了研究和总结。以此为基础，基于课题组之前发现的低纳摩尔级Keap1-Nrf2蛋白-蛋白相互作用抑制剂Compound 2的骨架结构，并以小分子配体的构效关系、优势骨架和活性碎片指导Keap1结合机制的再研究和抑制剂的再设计，从而丰富Keap1-Nrf2抑制剂的母环结构。
四、研究手段
（1）基于荧光偏振的Keap1-Nrf2蛋白-蛋白相互作用抑制实验
（2）基于生物膜干涉的Keap1结合实验
（3）ARE荧光素酶报告基因实验
（4）Western blot 检测目标化合物对Nrf2下游蛋白的影响
五、工作进度
2018年3月-4月
对已有的信息进行综合分析，总结优势碎片结构，开展抑制剂分子设计与合成实验，合成基于Keap1活性口袋全占据的Keap1-Nrf2抑制剂10个。
2018年5月
对已合成的化合物进行细胞水平的Nrf2-ARE诱导活性测试、细胞水平Nrf2-ARE诱导活性及Nrf2下游激活效应测定，分析与总结各类碎片在Keap1-Nrf2抑制剂活性中的构效关系，为今后抑制剂的发现提供新思路。
主要参考论文：
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2. Cho, H. Y.; Reddy, S. P.; Kleeberger, S. R., Nrf2 defends the lung from oxidative stress. Antioxidants redox signaling 2006, 8 (1-2), 76-87.
3. Itoh, K.; Wakabayashi, N.; Katoh, Y.; Ishii, T.; Igarashi, K.; Engel, J. D.; Yamamoto, M., Keap1 represses nuclear activation of antioxidant responsive elements by Nrf2 through binding to the amino-terminal Neh2 domain. Genes development 1999, 13 (1), 76-86.
4. Jain, A. K.; Bloom, D. A.; Jaiswal, A. K., Nuclear import and export signals in control of Nrf2. The Journal of biological chemistry 2005, 280 (32), 29158-68.
5. Jung, K. A.; Kwak, M. K., The Nrf2 System as a Potential Target for the Development of Indirect Antioxidants. Molecules 2010, 15 (10), 7266-7291.
6. McMahon, M.; Thomas, N.; Itoh, K.; Yamamoto, M.; Hayes, J. D., Redox-regulated turnover of Nrf2 is determined by at least two separate protein domains, the redox-sensitive Neh2 degron and the redox-insensitive Neh6 degron. Journal of Biological Chemistry 2004, 279 (30), 31556-31567.
7. Tkachev, V. O.; Menshchikova, E. B.; Zenkov, N. K., Mechanism of the Nrf2/Keap1/ARE signaling system. Biochemistry-Moscow 2011, 76 (4), 407-422.
8. Uruno, A.; Motohashi, H., The Keap1Nrf2 system as an in vivo sensor for electrophiles. Nitric Oxide 2011, 25 (2), 153-160.
9. Eggler, A. L.; Small, E.; Hannink, M.; Mesecar, A. D., Cul3-mediated Nrf2 ubiquitination and antioxidant response element (ARE) activation are dependent on the partial molar volume at position 151 of Keap1. Biochem J 2009, 422, 171-180.
10. Finkel, T.; Holbrook, N. J., Oxidants, oxidative stress and the biology of ageing. Nature 2000, 408 (6809), 239-47.
11. Chartoumpekis, D. V.; Wakabayashi, N.; Kensler, T. W., Keap1/Nrf2 pathway in the frontiers of cancer and non-cancer cell metabolism. Biochemical Society transactions 2015, 43 (4), 639-44.
12. Copple, I. M., The Keap1-Nrf2 cell defense pathway--a promising therapeutic target? Advances in pharmacology 2012, 63, 43-79.
13. Dinkova-Kostova, A. T.; Massiah, M. A.; Bozak, R. E.; Hicks, R. J.; Talalay, P., Potency of Michael Reaction Acceptors as Inducers of Enzymes That Protect against Carcinogenesis Depends on Their Reactivity with Sulfhydryl Groups. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2001, 98 (6), 3404-3409.
14. Nakamura, Y.; Miyoshi, N., Electrophiles in Foods: The Current Status of Isothiocyanates and Their Chemical Biology. Biosci Biotech Bioch 2010, 74 (2), 242-255.
15. Jiang, Z. Y.; Lu, M. C.; Xu, L. L.; Yang, T. T.; Xi, M. Y.; Xu, X. L.; Guo, X. K.; Zhang, X. J.; You, Q. D.; Sun, H. P., Discovery of potent Keap1-Nrf2 protein-protein interaction inhibitor based on molecular binding determinants analysis. Journal of medicinal chemistry 2014, 57 (6), 2736-45.
一、研究内容
1、Keap1-Nrf2-ARE通路与氧化应激
Keap1-Nrf2-ARE信号通路是细胞中氧化应激的关键通路，是细胞防御系统的重要组成部分。
抗氧化反应元件ARE(antioxidant response element, 5-GTGACnnnGC-3)能介导超过 100个抗氧化基因的转录和抗氧化蛋白的表达，包括I相和II相解毒酶、转运蛋白、伴侣分子等1。在该信号通路中，ARE 与入核的转录因子 Nrf2 结合，受其调控。同时，细胞中游离的 Nrf2 的含量又主要受Keap1调控。
