汉黄芩素对VEGF诱导的血管通透性的影响文献综述

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自拟课题

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黄芩是《中国药典》收载的常用中药，为唇形科多年生草本植物黄芩的干燥根。黄芩性味苦寒，具有清热燥湿、解毒止血、安胎之功效，主治热病，用于肺热咳嗽、发烧感冒、急性痢疾、胃肠炎、痈肿疮毒、头痛、目赤肿痛等症。汉黄芩素即为黄芩的主要成分之一。近年来，国内外研究人员从不同方面对汉黄芩素的药理作用进行了深入的研究，发现汉黄芩素具抗炎、抗氧化、抗肿瘤及保护正常机体组织等多种活性。

血管内皮生长因子（VEGF）是一种特异地作用于血管内皮细胞的多功能细胞因子，具有促进微静脉及小静脉通透性增加、血管内皮细胞分裂、增殖、细胞质钙聚集以及诱导血管生成等作用，是目前已知最强的肿瘤血管生成诱导因子。一般成人体内VEGF呈低水平表达，高水平VEGF表达与卵泡发育、黄体生成、子宫内膜增生、胚胎着床等生殖过程有关^[1][1]。在血管生成过度活跃的病理状态，VEGF表达明显增加，缺氧、细胞因子、炎症因子、激素及癌基因等对VEGF含量及表达均有影响。

已有研究表明，汉黄芩素具具有较强的抗肿瘤作用，不仅能促进肿瘤细胞凋亡，诱导白血病细胞发生分化，还能通过抑制肿瘤血管生成抑制肿瘤组织生长。在汉黄芩素抑制肿瘤血管生成的研究中，血管内皮细胞的激活及运动能力受到明显抑制。而内皮细胞激活及运动能力增强是血管通透性升高的基础，前期研究表明，汉黄芩素能抑制炎症因子LPS诱导的血管通透性增强，但其对VEGF诱导的血管通透性的影响尚未见报导。本课题拟通过Transwell内皮细胞迁移实验、内皮细胞骨架染色、跨内皮细胞迁移、miles小鼠血管通透性检测等血管通透性研究的体内外模型来探究汉黄芩素对VEGF诱导的血管通透性的影响。^[2][2]

主要解决的问题:

本课题中我们利用几种VEGF诱导血管内皮细胞通透性模型来探讨汉黄芩素对VEGF诱导的血管通透性的影响。

血管通透性是指血管内各种物质通过血管的能力，正常生理条件下，水和电解质可通过毛细血管屏障进入组织间隙，白蛋白等大分子物质不能通过毛细血管屏障进入组织间隙，但在某些情况下，如严重的感染、创伤等某些突发因素可使单核-巨噬细胞系统、内皮细胞和中性粒细胞过度激活，使炎性细胞因子释放并介导免疫反应，毛细血管内皮细胞损伤，细胞连接分离、出现裂隙，经毛细血管运输通道的孔径增大、血管通透性增高。血管通透性受多种因素的调节，如血浆白蛋白水平、炎症递质、血小板激活因子、蛋白激酶G、内皮细胞黏附分子、细胞间黏附分子、一氧化氮、冲击波、氧分压和血氧饱和度、凝血酶及氧化剂等^[3][3]。在肿瘤发生与发展过程中，血管内皮细胞受到各类刺激因子的影响得以活化，内皮细胞运动性增强，细胞间粘附减弱，导致血管通透性升高；此时，血液中的各类刺激因子渗漏到肿瘤组织中，刺激肿瘤细胞分泌各类促血管生成因子，从而促进肿瘤血管生成，来维持肿瘤的生长与转移。

本课题从体内外研究汉黄芩素对VEGF诱导的血管通透性的影响。

1. 内皮细胞迁移实验

HUVECs接种于24孔板中，待密度达到70%时给予汉黄芩素（0、1、10和100 mu;M）处理4 h。消化细胞，用无血清培养基稀释配比成相同浓度的细胞悬液（5 times; 10⁵个/ml）。取Transwell小室与24孔板中，每组取上述细胞悬液400 mu;l加入Transwell小室上室中，下室加入VEGF（0或10 ng/ml）。37 °C、5% CO₂培养箱中孵育4 h后，取出Transwell小室，用棉签轻轻擦去微孔滤膜内侧未穿过的细胞，用100%甲醇固定滤膜2 min，苏木精染色15 min，伊红染色1 min。最后用水冲洗，棉签擦干，随机于显微镜下取上、下、左、右、中心共5个视野，计算细胞迁移的平均数。比较对照组与各给药组数据，判断药物作用。实验重复3次。所得数据使用SPSS分析软件进行one-way ANOVA分析。

1. 免疫荧光

HUVECs接种于盖玻片上，待细胞汇合后加入不同浓度的汉黄芩素（0、1、10和100 micro;M）处理4 h，然后分别用VEGF（0或10 ng/ml）处理细胞10 min。取出盖玻片，置于六孔板中。PBS缓慢摇晃清洗3遍，每遍5 min。加入2 ml 4%多聚甲醛固定20 min，PBS缓慢摇晃清洗3遍，每遍5 min。0.2% Triton X-100透化10 min，PBS缓慢摇晃清洗3遍，每遍5 min。1% BSA封闭1 h。PBS缓慢摇晃清洗3遍，每遍5 min。FITC标记Phalloidin用PBS稀释至工作液浓度（1:30），室温孵育1 h。PBS缓慢摇晃清洗3遍，每遍5 min。DAPI染细胞核20 min。PBS清洗3遍后，取出，封片，避光干燥，激光共聚焦显微镜拍摄。

1. 跨内皮细胞迁移实验

消化细胞，将混匀的HUVECs稀释重悬，浓度为1 times; 10⁴个/ml。取出Transwell小室，放入细胞培养板中（24孔板），每组取上述HUVECs悬液400 mu;l加入上室中。放入细胞培养箱中孵育，待细胞汇合后，加入不同浓度的汉黄芩素（0、1、10和100 micro;M）处理4 h。然后分别用VEGF (0或10 ng/ml)处理细胞10 min，PBS清洗。取MDA-MA-231细胞，消化，用无血清培养基稀释配比成相同浓度的细胞悬液（5 times; 10⁵个/ml）。每组取上述细胞悬液400 mu;l加入上室中，下室加入全血清培养基600 mu;l。37°C孵育4 h后，取出Transwell小室，用棉签轻轻擦去微孔滤膜内侧未穿过的细胞，用100%甲醇固定滤膜2 min，苏木精染色15 min，伊红染色1 min。最后用水冲洗，棉签擦干，随机于显微镜下取上、下、左、右、中心共5个视野，计算细胞迁移的平均数。比较对照组与各给药组数据，判断药物作用。实验重复3次。所得数据使用SPSS分析软件进行one-way ANOVA分析。

1. MILES血管通透性检测

取雄性BALB/c小鼠，按处理因素随机分成空白对照组，VEGF 模型组和汉黄芩素给药组（20、40、80 mg/kg）共5组，每组七只。汉黄芩素给药组小鼠尾静脉注射（i.v.）给药，连续给药六天。尾静脉注射1% 伊文思蓝溶液100 mg/kg，20 min后，VEGF模型组和汉黄芩素给药组均经背部皮肤注射VEGF 10 mu;l（7 ng/ml），空白对照组给予同等体积的生理盐水。20 min后处死小鼠，取下背部蓝染皮肤。以蓝斑部位大小表示渗透强弱。

1. 免疫印记实验

（1）收细胞：HUVECs接种于细胞培养皿中，待密度达到70%时给予汉黄芩素（0、1、10和100 mu;M）处理4 h，然后分别用VEGF (0或10 ng/ml)处理细胞10 min，2500 rpm离心收集细胞。

（2）提蛋白：用冷PBS洗两次，尽量弃去残余的PBS。用适量体积冷细胞裂解液或者磷酸化裂解液（62.5 mM Tris-HCl [pH 6.8]，2% wt/vol sodium dodecyl sulfate [SDS]，10% glycerol，50 mM dithiothreitol [DTT]，0.01%溴酚兰）重悬细胞，冰上放置50 min，充分裂解细胞。将细胞裂解液4C 13000 rpm 离心30 min，上清液为抽取的总蛋白。用BCA法测定蛋白含量，并稀释成相同的浓度。然后将同等总蛋白量的不同处理样品按1:3与4 times; loading buffer混匀，沸水浴变性5 min后，于-20C保存。

（3）制胶和电泳：制备8% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，80 V浓缩胶，120 V分离胶，2.5～3 h。

（4）转膜：电泳后取下胶，按尺寸剪取合适大小的Whatmann滤纸及硝酸纤维素膜，上下各一层滤纸，中间为胶和膜，胶在负极，膜在正极，用玻棒仔细赶除气泡，采用半干式转膜，恒压23 V，时间根据相应的蛋白KD数进行调整，转移蛋白到硝纤膜。

（5）丽染和封闭：将转入蛋白的硝纤膜浸入丽春红工作液中，染色2～5 min后，蒸馏水冲洗，观察转膜效率，标记蛋白，用PBST洗去。丽春红条带。用10%脱脂奶粉，37C封闭1 h。

（6）抗体孵育：弃封闭液，用少量PBS将残余奶粉漂洗干净，封口机将各条膜封闭于自封袋中，尽可能排除气泡。一抗用PBST稀释至工作液浓度，37C恒温摇床反应1～2 h，4C孵育过夜；用PBST清洗5次，6 min/次。用PBST稀释二抗至工作液浓度，按前法封袋，37C恒温摇床反应1 h。反应结束后弃二抗，用PBST清洗5次，10 min/次。

（7）扫描结果：PBS清洗2次，6 min/次；用Odyssey近红外荧光扫描成像系统扫膜。

参考文献

[1]何天源，陈诗书 血管内皮生长因子与血管生成

[2]Song, X., Y. Zhou, M. Zhou, Y. Huang, Z. Li, Q. You, N. Lu, and Q. Guo, Wogonin influences vascular permeability via Wnt/beta-catenin pathway. Mol Carcinog, 2013.

[3]孟淑静，曹春蕊，任艳焕，马冬雪 血管通透性及其相关因素研究进展

附录

综述

血管内皮生长因子（VEGF）对血管通透性的影响研究综述

1．血管通透性

血管通透性是指血管内各种物质通过的能力，正常生理条件下，水和电解质可通过毛细血管屏障进入组织间隙，白蛋白等大分子物质不能通过毛细血管屏障进入组织问隙，但在某些情况下，如严重的感染、创伤等某些突发因素可使单核-巨噬细胞系统、内皮细胞和中性粒细胞过度激活，使炎性细胞因子释放和介导免疫反应参与，毛细血管内皮细胞损伤，细胞连接分离、出现裂隙，经毛细血管运输通道的孔径增大、血管通透性增高。血管通透性受多种因素的调节，如血浆白蛋白水平、炎症递质、血小板激活凶子、蛋白激酶G、内皮细胞黏附分子、细胞间黏附分子、一氧化氮、冲击波、氧分压和血氧饱和度、凝血酶及氧化剂等。

2．血管通透性的调节因素

2.1血浆渗透压水平。血浆胶体渗透压主要由蛋白质分子构成，其中，血浆白蛋白分子量较小，数目较多(白蛋白gt;球蛋白gt;纤维蛋白原)，决定血浆胶体渗透压的大小。由于组织液中蛋白质很少，所以血浆的胶体渗透压高于组织液。在血浆蛋白中，白蛋白的分子量远小于球蛋白，故血浆胶体渗透压主要来自白蛋白。若白蛋白明显减少，即使球蛋白增加而保持血浆蛋白总含量基本不变，血浆胶体渗透压也将明显降低。慢性肝病时，肝脏合成白蛋白减少，血浆胶体渗透压也将降低，致血管通透性增加，血浆外渗。

2.2 一氧化氮。一氧化氮(NO)具有多种生物学作用，在生理条件下，内源性NO作为调节心血管系统、神经系统和免疫系统的递质，发挥其调节微血管通透性的作用。在病理条件下，血管活性递质可诱导表达产生大量NO，使NO可达到相当高的浓度，从而影响血管内皮细胞的屏障功能，使之通透性升高。

2.3血小板活化因子。血小板活化因子是一种与花生四烯酸代谢密切相关的高活性的磷脂类递质，主要由活化的内皮细胞、血小板和中性粒细胞等释放，作用于内皮细胞膜上的PAF受体，导致内皮细胞收缩或损伤，使通透性增加。PAF可诱导中性粒细胞与内皮间相互作用，激活中性粒细胞和内皮细胞，促使白细胞黏附于微血管壁上导致内皮细胞受损，且具有剂量依赖性和可逆性的特点。

2.4血管通透因子。血管通透因子(VEGF)为分子量46KD的同源一聚体糖蛋白，是高度特异的内皮细胞丝裂原，有两种受体，即含激酶领域区受体和fms样酪氨酸激酶I。VEGF的特异性表现在：只有血管内皮细胞具有其受体，VEGF与受体结合后，具有促进血管内皮细胞增生和提高微血管对大分子物质通透性的作用。VEGF的作用依赖于NO的存在，血中NO水平增高时，血管通透性增加。

2.5炎性递质。炎性递质是炎症过程中形成或释放的参与炎症反应的活性物质。在炎症和应激条件下，机体可产生许多炎症递质和细胞因子，如：组胺、血栓素、缓激肽、肿瘤坏死因子alpha; 、血管内皮生长因子、血小板活化因子等，这些因子均可引起血管内皮细胞连接损伤和功能障碍，从而导致血管通透性增强，形成组织水肿，但不改变微静脉的口径。

2.6 蛋白激酶G。PKG是重要的信息分子NO的下游底物，是引起血管平滑肌舒张的重要激酶，从而介导平滑肌细胞的松弛以及血管的舒张，改变其通透性。^[4][1]

3．VEGF生物活性的调控

3.1 缺氧对VEGF合成的调节作用。缺氧条件下，细胞分泌VEGF的量明显上升，缺氧刺激下细胞合成一种缺氧诱导蛋白，该蛋白可以激活正常的缺氧感受基因，从而调控VEGF的表达。另外，缺氧不仅可以诱导VEGF的转录，还可以增强VEGF mRNA的稳定性，防止降解，从而间接提高VEGF的生理活性。

3.2 癌基因对VEGF表达的调控。许多癌基因具有促进或抑制VEGF基因表达功能，前者主要是促癌基因，如缺氧可以刺激sre基因的表达，间接促进VEGF的表达；后者是一些抑癌基因，如VHL基因突变后上调VEGF的表达，促进肿瘤的血管增生，促进肿瘤的生长转移。

3.3 细胞因子和炎症因子对VEGF表达调控。在肿瘤的生长或炎症的形成过程中，多种细胞因子对VEGF的合成起重要的调节作用，它们可以作用于不同水平，促进或抑制VEGF的表达，共同参与某种病理生理过程。

4．VEGF及其受体和血管

4.1 VEGF及VEGFR与血管发生。VEGF作为血管发生的中枢调节因子，在胚胎发育期生成量的减少会导致具有致命影响的血管生成减少。同样，编码VEGFR-1和VEGFR-2的基因的断裂也可导致纯合子动物严重的血管形成异常。

4.2 VEGF及VEGFR与血管生成。VEGF能增强血浆酶原活化因子活性，提高血浆酶原活化因子和血浆酶原活化因子抑制因子的mRNA的水平，促进细胞外蛋白水解，有利于毛细血管的生成；同时，VEGF可改变内皮细胞基因的活化形式，诱导内皮细胞表达蛋白水解酶、间质胶原酶和组织因子来促进血管生成。^[5][2]

5．VEGF对血管及血管通透性的作用

5.1 诱导相关因子表达。VEGF可以诱导内皮细胞表达血浆蛋白溶酶原激活物及血浆溶酶原激活物抑制剂-1，以及诱导组织因子、基质胶原酶等在内皮细胞的表达，激发Ⅷ因子从内皮细胞中释放。

5.2 促进内皮细胞的增殖和血管生成功能。无论在生理还是病理情况下，VEGF均能促进新生血管的形成，调节血管生成的大多数环节，包括内皮细胞外基质溶解，内皮细胞迁移、增生和管腔形成，增加细胞间黏附和血管细胞黏附分子水平及诱导内皮细胞上相应的配体和受体的表达等。[3]

5.3 增加血管的通透性。VEGF主要通过增加内皮细胞的间隙实现增加血管通透性。另有研究认为VEGF是通过刺激内皮细胞产生基质降解蛋白酶类，特别是基质金属蛋白酶2 (MMP2)降解微血管基底膜和细胞外基质．破坏血管壁的完整性，从而增加通透性。VEGF增加血管通透性的作用晚于其保护作用。

VEGF是已知最强的血管渗透因子，其作用是组胺的5万倍。肿瘤血管渗透性的增加会促使许多血浆蛋白漏出并在间质中沉积，抑制组织液回流，使正常组织变成促血管生成的环境。VEGF 可以增加许多血管床的通透性，包括皮肤、胸膜、腹膜及肠系膜等，可以形成恶性胸腹水。^[6][4] VEGF引起血管通透性增高的机制目前仍不十分清楚，对VEGF诱导血管生长及炎性作用之间的关系也知之甚少。目前已知VEGF-A与内皮细胞上两种特异受体作用，它们是VEGF-A与内皮细胞上两种特异受体作用，它们是VEGF-R1和VEGF-R2。两种受体均为膜受体，同属受体酪氨酸激酶，基本只存在于血管内皮细胞中。对VEGF通透机制的研究主要在以下几个方面：

1） Ca^[7]2 依赖性通道。VEGF通过增加钙流来提高水压传导率。

2） 血小板活化因子的合成。VEGF能诱导PAF的合成及增加血管蛋白的通透。

3） 诱导内皮细胞穿孔。

4） NO和前列环素。VEGF促进血管内皮细胞NO及前列环素的合成，血管松弛，通透增加。

5） 内皮细胞膜表面小凹介导。VEGF代表一种决定血管系统生长、分化及环境适应的旁分泌信号系统。VEGF增加血管内皮通透的细胞途径与膜表面小凹有关。

此外，缺血、缺氧、激素、NO、肝素等也可影响VEGF的血管通透效应。^[8][3]

参考文献

1. 孟淑静，曹春蕊，任艳焕，马冬雪 血管通透性及其相关因素研究进展
2. 陈磊，史晨辉 血管内皮生长因子与血管形成
3. 郭敬 血管内皮生长因子与治疗性血管生成研究进展
4. 吴华英 血管内皮因子在肿瘤血管的研究进展