不同CHO细胞在GS筛选系统下稳定株的构建及其产物生物学特性研究文献综述

 2022-12-20 22:55:27
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开题报告内容:(包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述,不少于2000字)

  1. 选题目的:

随着科技的发展,单克隆抗体药物已经成为了医药领域的重要组成成分,而CHO细胞是抗体生产的最优宿主,CHO细胞的生产构建通常会包括分子构建、稳定细胞株筛选、上游发酵工艺开发、下游纯化工艺开发和制剂工艺开发几部分[1],而获得一株稳定高产细胞株的便尤为重要,它不仅可以增加抗体产量,降低成本,还能降低纯化下游产品的复杂程度,确保获得安全、有效的抗体。

因此本研究旨在在GS筛选系统的基础上构建CHO细胞稳定株,对电转条件进行优化,96孔有限稀释法筛选细胞单克隆,通过细胞扩增、亚克隆筛选出高表达的细胞株并对抗体的理化性质进行研究,希望能建立基于GS系统的CHO细胞稳定株的构建方法,简化筛选方法,减少筛选时间。

二、综述:

抗体是由免疫细胞经抗原刺激后产生的能与抗原发生特异性反应的免疫球蛋白,而只针对某一特定抗原决定簇起作用的抗体被称为单克隆抗体(简称单抗,mAb)。[2]根据SFDA在2016-2017年对全球最畅销的十大药物中的统计显示,其中6个是单抗药物,2个是小分子药物,2个是融合蛋白药物,可以看出单抗药物的发展前景和优势。

单抗是一类四聚体糖蛋白,抗体的轻、重链需要经过折叠、组装和适当的糖基化修饰才能具有生物学活性。由于转基因植物、昆虫细胞和酵母细胞等不具有翻译后修饰的能力,所以单抗的表达只有哺乳动物细胞比较适合。[3]经常使用的哺乳动物细胞有小鼠骨髓淋巴瘤细胞,中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells,CHO),人类胚胎肾293细胞等,[4]其中CHO细胞是最常用的表达系统。到2018年,经FDA或EMA批准上市的抗体药物已经超过70种,批准上市的抗体药物中51种是由CHO细胞产生的。在CHO细胞表达系统中,谷氨酰胺合成酶(GS)筛选系统和二氢叶酸还原酶(DHFR)是最常用的筛选系统。

1、DHFR系统:

DHFR基因编码的二氢叶酸还原酶是细胞代谢途径中一个重要的酶,宿主细胞DHFR基因的缺失会使细胞自身无法合成四氢叶酸,抑制DNA的合成,从而导致细胞死亡。当缺失DHFR基因的CHO细胞系(如CHO-DG44)在不含HT的培养基进行培养时,需要不断的提高MTX(氨甲蝶呤,抑制DHFR酶)的浓度,使细胞扩增更多的DHFR基因从而实现目的基因的扩增。但这个过程花费的时间很长且在去除MTX后有潜在的不稳定性。[5]

2、GS系统:

GS系统是利用哺乳动物谷氨酰胺代谢的过程。当培养基中没有添加谷氨酰胺时,哺乳动物细胞的存活就需要生成谷氨酰胺合成酶。利用GS基因作为筛选标记就可以使哺乳动物细胞在没有谷氨酰胺的培养基中存活。本身就具有GS基因的也可以通过添加更高含量的MSX(甲硫氨酸亚砜亚铵,GS抑制剂)抑制内源GS的活性。只有转染了外源GS基因的细胞才能在高剂量MSX的作用下存活。[6]GS系统与DHFR系统相比较有明显的优越性,目前临床实验中已有超过50个产品和2个已上市抗体是利用GS系统产生的。GS系统以CHO-K1为宿主细胞,它的优点在于:①CHO-K1易培养,更强壮②不需要基因缺陷型CHO-K1细胞作为宿主细胞③无需在培养基中加入谷氨酰胺,避免因为谷氨酰胺分解而造成培养体系中氨水平高,降低了工艺控制的难度,提高了细胞的发酵密度和细胞生存时间。因此在本次研究中主要以GS系统为研究对象进行实验。[7]

虽然CHO细胞表达系统存在很多的优势,但它也存在着一定的缺陷,如表达的糖基化产物不稳定,不易纯化,长期传代不稳定等等。在传统方法中,外源基因是随机整合到细胞基因组中,整合位点不确定性也可能会引起表达的不确定性。因此从不稳定的基因组中找到可以稳定表达外源基因的位点,并将目的基因定点整合于该位点已逐渐成为研究热点,如使用锌指核酸酶(ZFN)、CRISPR/Cas9技术和转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)等。[8]

细胞株筛选流程是由一系列清晰明确的步骤组成的,主要分为载体构建、细胞转染、细胞株构建、工艺优化、放大生产这五个步骤。获得一个稳定表达的细胞株对于商业生产外源重组蛋白来说是尤为重要的,细胞株的稳定性直接影响到了从工程细胞的扩大培养到规模化生产的重组蛋白的产率。[9]

外源基因转染细胞常用的方法有电转染法、磷酸钙共沉淀法、显微注射法、脂质体转染法等等,而电转染法因为具有操作简便、重复性高和转染率高等优点常常被用于在工业上转染CHO细胞。[10]但转染条件的不同会极大的影响电转染效率,比如电压、转染质粒量、脉冲次数等等都会影响转染效率[11],因此我们需要对电转参数进行探索,提高转染效率,为抗体的表达奠定实验基础。

现在细胞株的构建技术已经非常成熟了,高通量的筛选方法已经让细胞株的构建过程不像以前那样枯燥冗长,并且细胞株的表达水平也有极大的提高,但高表达量往往伴随着产品质量的下降,因此我们需要对CHO细胞表达的抗体的生物学特性进行全面的分析。[12]

不同的细胞产生的抗体质量也有所不同,其中抗体多聚体的含量的多少是最为重要的,因为抗体多聚体会增强抗体的免疫原性,可能会引起不良反应[13],对药物的安全性、有效性、质量可控性都有着非常大的影响。而SEC(Size exclusion chromatography,体积排阻色谱)常用于抗体多聚体的检测[14]

同时糖基化修饰也是抗体生产中非常关键的质量属性,它与抗体的活性、体内半衰期、稳定性、构象、ADCC效应等等性质有关。如半乳糖修饰可以提高抗体和补体的亲和力,增强CDC效应[15];唾液酸化可以提高在血清中的半衰期或者抗炎活性等等[16]

GS系统的专利原由Lonza公司垄断,随着专利过期,越来越多的公司开始使用GS系统。目前中国的抗体药物产业正进入关键的发展时期,需要不断的吸取国外经验,结合自身实际,在细胞株开发方面不断的突破创新,促使整个抗体药物产业健康发展。

三、选题研究的内容及方法:

构建CHO细胞稳定株是通过电转的方式将质粒转染进细胞内的。为了确定最优电转方案,我们对细胞电转的影响因素进行了探究,电转的主要影响因素有电压、电转缓冲液、脉冲次数和质粒含量等等,不同的细胞有不同的最优电转条件,且转染效率在不同的实验室中也不同。因此我们需要制定一套相对稳定的标准化方法来对不同细胞株的最佳条件进行探究。由于影响电转的因素太多,因此在本实验中将采用正交实验,探索电转参数的最优组合。[17]

在确定最优电转方案后,我们将对CHO细胞进行筛选,常用的筛选方法有Clone Pix System筛选法,96孔单克隆有限稀释法和流式细胞仪法,在这里我们将选用96孔单克隆有限稀释法作为我们的筛选方法。挑选出单克隆后进行细胞扩增和亚克隆,用Octet对抗体含量进行检测,并对抗体的质量进行检测分析——用SDS-PAGE确定蛋白分子正确性,用SEC检测抗体是否容易形成多聚体,用糖型分析避免一些糖型较差的克隆等等。

四、工作进度

2020年3月20号前:学生查看任务书,提交外文翻译材料,上传开题报告。

2020年4月15号前:用mini pool和bulk pool两种方式进行细胞接种。使用bulk pool进行接种的可以开始进行细胞筛选。

2020年4月18号前:学生填写中期检查表。可以改变电转条件,用bulk pool进行细胞接种,探索不同电转条件对不同细胞株的影响。

2020年5月15号前:用mini pool进行细胞接种的可以开始进行细胞筛选,进行亚克隆和细胞扩增。

2020年5月25号前:完成抗体浓度的检测,qPCR,抗体纯化。

2020年6月5号前:完成SEC、电泳、糖型分析。

2020年6月10号前:完成毕业论文初稿并上传毕设系统,指导老师审核论文初稿。

五、参考文献

学生签名: 年 月 日

指导教师意见:

指导教师签名: 年 月 日

所在教研室(实习单位)审查意见:

负责人签名: 年 月 日

填写说明

1.指导教师意见填写对文献综述的评语,对本课题的深度、广度及工作量的意见和对论文结果的预测;

2.所在教研室(实习单位)审查意见包括对指导教师意见的认定和是否同意开题等。

  1. https://www.sohu.com/a/166891508_464404 uarr;

  2. 陶维红, 李宗海, 李荣秀. 我国单克隆抗体药物产业化进展浅谈[J]. 生物产业技术, 2019(2):75-80. uarr;

  3. 李艳梅, 田政伟, 徐丹华, et al. CHO细胞重组抗体表达载体的构建策略及进展[J]. 中国细胞生物学学报, 2018, 40(11):172-178. uarr;

  4. 张梦筱, 朱建伟, 路慧丽. 抗体药物表达技术最新进展[J]. 生物工程学报, 2019, 35(02):6-17. uarr;

  5. Lin P C , Chan K F , Kiess I A , et al. Attenuated glutamine synthetase as selection marker in CHO cells to efficiently isolate highly productive stable cells for production of antibodies and other biologics[J]. Mabs, 2019. uarr;

  6. 傅雅娟.基于CHO DG44细胞的稳定高产细胞株筛选系统的初步建立[D].福建:厦门大学,2013. uarr;

  7. 陶维红, 秦民民, 张哲如. Strategy Discussion for CHO Cell Line Development%CHO细胞株开发技术策略探讨[J]. 生物技术进展, 2014, 004(006):394-399. uarr;

  8. 周松涛. CHO细胞定点整合稳定表达治疗性蛋白质的研究[D].江南大学,2019. uarr;

  9. 周宏(综述)[1], 刘志刚(综述)[1], 俞炜源(审阅)[1]. 克服位置效应提高外源基因在CHO细胞中稳定高效表达的策略[J]. 生物技术通讯, 2006(6). uarr;

  10. 李计来,崔文禹,刘敬,郝少杰,徐静.CHO DG44细胞电转染条件的优化[J].中国生物制品学杂志,2017,30(11):1207-1210. uarr;

  11. 杨薇, 王迪, 陈克清, et al. 质粒电穿孔转染条件的选择[J]. 华中科技大学学报(医学版), 2009, 38(6):858-860. uarr;

  12. 朱向阳.抗体药物工艺开发需要考虑的因素[J].中国新药杂志,2015,24(20):2363-2368. uarr;

  13. Ishii Y , Murakami J , Sasaki K , et al. Efficient folding/assembly in Chinese hamster ovary cells is critical for high quality (low aggregate content) of secreted trastuzumab as well as for high production: Stepwise multivariate regression analyses[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2014, 118(2):223-230. uarr;

  14. 张晓敏, 胡志上, 李红梅. 体积排阻色谱在蛋白质药物聚集体领域的应用[J]. 分析测试学报, 2019(7). uarr;

  15. 江一帆,贾宇,王龙,王志明.细胞培养过程对单克隆抗体糖基化修饰的影响和调控[J].中国生物工程杂志,2019,39(08):95-103. uarr;

  16. David, Reinhart, Lukas, et al. Bioprocessing of Recombinant CHO‐K1, CHO‐DG44, and CHO‐S: CHO Expression Hosts Favor Either mAb Production or Biomass Synthesis[J]. Biotechnology Journal, 2019. uarr;

  17. 陆俭, 李萍, 马亚茹, et al. 正交设计优化电转染CHO细胞的方法[J]. 生物技术通讯, 2011(05):117-120. uarr;

资料编号:[374687]

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