胰蛋白酶抑制剂的制备及其活性鉴定文献综述

 2022-12-22 19:55:29
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开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

一、课题研究背景、意义及目的

胰蛋白酶Trypsin为蛋白酶的一种，是从牛、羊、猪的胰脏提取的一种丝氨酸蛋白水解酶。在脊椎动物中，作为消化酶而起作用。在胰脏是胰蛋白酶的前体胰蛋白酶原被合成后，作为胰液的成分而分泌，受肠激酶，或胰蛋白酶的限制分解成为活化胰蛋白酶，是肽链内切酶，它能把多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断。它不仅起消化酶的作用，而且还能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前体，起活化作用。胰蛋白酶也是特异性最强的蛋白酶，在决定蛋白质的氨基酸排列中，它成为不可缺少的工具。胰蛋白酶有清除血凝块、脓液、炎性渗出物的作用，其注射剂在临床上常用于坏死性创伤、溃疡、脓肿、炎症的辅助治疗及眼外伤和各类眼部炎症的治疗。胰蛋白酶还可以分解毒素，用于被毒蛇咬伤后的救治。其在水溶液中稳定性较差，故常制成粉针剂，待使用时进行配液。

胰蛋白酶抑制剂(Trypsin inhibitor，TI)是一种能够抑制胰蛋白酶活性的多肽或蛋白，自然界中有许多种胰蛋白酶抑制剂，包括各种动物，植物等含有不同种类的胰蛋白酶抑制剂。胰蛋白酶抑制剂在治疗急性胰腺炎、预防早产、防治脑缺血和脑水肿等方面的临床用药中均取得了良好效果。目前，对胰蛋白酶抑制剂的研究主要集中在它的抗肿瘤作用方面，是分子靶向治疗肿瘤的研究热点。多项体外研究表明，胰蛋白酶抑制剂可与多种抗癌药物联用，增强化疗药物疗效、减少耐药性。本课题研究的是鸡蛋清中的卵类粘蛋白，可以抑制猪、牛、羊的胰蛋白酶活性，对人的胰蛋白酶活性不发生作用。

本实验采用偶联胰蛋白酶的琼脂糖凝胶4B载体作为亲和吸附剂，在一定的pH和离子强度下，通过亲和层析将鸡蛋清中的卵类粘蛋白吸附于柱上，再改变条件将其洗脱下来，达到提取、纯化的目的。

二、课题研究的主要内容

本课题是在现有的研究报道基础上，对胰蛋白酶抑制剂进行亲和纯化以及活性鉴定。主要内容包括：

1 使用固定化胰蛋白酶对卵类粘蛋白进行亲和层析

2 对卵类粘蛋白进行活性鉴定

三、论文研究的进展计划

2020/03---2020/04 查询、阅读整理文献和实验思路设计实验方案及实验技能的训练

2020/04—2020/05 制备固定化胰蛋白酶并进行亲和纯化以及对卵类粘蛋白进行效价测定

2020/05—2020/06 整理实验记录、撰写毕业设计、准备毕业答辩

  1. 文献综述：

胰蛋白酶抑制剂的制备与应用

【摘要】：胰蛋白酶抑制剂作为丝氨酸蛋白酶抑制剂家族，应用非常广泛，其不仅可用于防病虫害，近年的科学研究表明，胰蛋白酶抑制剂在抗癌，抗病毒等方面也有着巨大作用。

【关键词】：胰蛋白酶抑制剂 纯化制备 疾病治疗

【正文】

1、前言

1.1胰蛋白酶

胰蛋白酶(Trypsin)作为一种消化酶在脊椎动物的消化系统中起着巨大作用，它属于肽链内切酶，可切割多肽链中的赖氨酸和精氨酸残基中的羧基端切断。其作为研究热点，广泛用于轻工业、医药工业、食品加工业、畜牧业和现代生物技术领域，具有重要科学研究价值，在体内它具有“双重”作用，不仅可以催化普通蛋白质，也可以激活胰腺分泌的其它酶原[[1]]。胰蛋白酶原前体[[2]]含有一段由15 个氨基酸组成的信号肽序列和一个由6~8 个氨基酸组成的激活肽（TAP）序列。若信号肽序列被结合于内质网膜上的信号肽酶切除，则胰蛋白酶原前体转变成胰蛋白酶原；若其中的激活肽序列再被肠肽酶水解掉，最后转变为具有活性的胰蛋白酶。胰蛋白酶一般存在于高等动物胰液和低等动物胃液中，也广泛存在于鸟类的肝脏、胰腺和肠道内,大多数脊椎动物体内的胰蛋白酶以上述形式被活化，而对于在无脊椎动物（如昆虫及甲壳动物），其激活机制可能是“自我活化”。[[3]]

胰蛋白酶的应用广泛，因此对于胰蛋白酶的研究就显得极为重要，而胰蛋白酶广泛存在于自然界中，首先，通过对昆虫胰蛋白酶基因结构和蛋白质结构的研究，不仅有利于达到控制有害昆虫的目的，还可以对有益昆虫进行疾病防御治疗，在动物养殖和农业生产上具有重要的潜在价值。[[4]-[5][6][7]]通过对鱼类胰蛋白酶基因进行研究，胰蛋白酶存在于鱼类肝胰腺、肠道和幽门盲囊，其活性的高低在调节鱼体的生长速度过程中亦具有重要作用。它是鱼类早期发育阶段一种重要的蛋白水解酶，深入研究其发生、变化及表达调控等，对仔幼鱼的营养生理及研发替活饵料的仔幼鱼人工饲料等方面具有重要意义。[[8]-[9][10][11]]而在鸟类中，胰蛋白酶对其同样非常重要，因为蛋白酶是鸟类蛋白质消化的重要酶类，直接关联到鸟类的饮食和消化。研究鸟类在不同环境下，消化系统的变化和胰蛋白酶的合成分泌，不仅能够为鸟类的饲养提供科学依据，同时也可根据鸟类消化道的变化和胰蛋白酶的分泌规律间接了解环境变化，为环境监测和保护提供依据。哺乳动物的胰蛋白酶有重要的功能，对机体的翻译和消化起着重要的作用。[[12]]

本实验采用的是共价偶联法来制备固定化酶，即使用已经用溴化氰（CNBr）活化好的琼脂糖凝胶Sepharose 4B，在弱碱的条件下直接偶联胰蛋白酶的游离氨基，获得固定化酶。

1.2胰蛋白酶抑制剂

胰蛋白酶抑制剂是指对胰蛋白酶具有抑制作用的一类物质，最早是由Kunitz从牛胰腺中提取的胰蛋白酶抑制剂, 现在发现在动物、植物、微生物中都广泛存在, 并且不同来源的胰蛋白酶抑制剂具有不同的相对分子质量、氨基酸组成、氨基酸序列及分子结构，根据分子质量、反应位点数和半胱氨酸含量，可分为Bowman-Birk型、Kunitz型、Kazal型、Potato Ⅰ型和Potato Ⅱ型五种[[13]]，其中研究较为深入的是Bowman-Birk型和Kunitz型抑制剂。其不仅起消化酶的作用，而且能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其他酶的前体，起活化作用。胰蛋白酶抑制剂与胰蛋白酶(或糜蛋白酶)相互反应时，抑制剂暴露在外的活性中心(反应位点)与靶酶的活性中心通过氢键相连，形成稳定的复合物，从而导致酶活性中心的闭锁，使靶酶的活性丧失，且此反应是不可逆的。与通常的酶催化反应相比，胰蛋白酶与其抑制剂之间反应的米氏常数(Km)很低，故胰蛋白酶与其抑制剂的亲和力大，两者可以迅速结合成无活性、不可逆的复合物。[[14]]

1.2.1 胰蛋白酶抑制剂的制备

由于胰蛋白酶抑制剂广泛存在于自然界中，动物、植物、微生物等均有胰蛋白酶抑制剂的存在，因而其制备方法也多种多样。

尿胰蛋白酶抑制物(Urinary trypsin inhibitor，UTI)是一种对酸对热较稳定的丝氨酸蛋白酶抑制物，存在于人和其它动物的血和尿中，尿胰蛋白酶抑制剂目前可采用的方法有综合使用三氯醋酸、硫酸铵、甲醇沉淀法，并加以使用亲和层析，离子交换层析，分子筛技术。[[15]]如王晓杰[[16]]以健康男性尿为原料,经甲壳素吸附、65%硫酸铵盐析得到尿胰蛋白酶抑制剂粗品;经DEAE-Sepharose离子交换层析、胰蛋白酶-Sepharose-4B亲和层析、Sephacry-200HR凝胶层析得到UTI纯品。范俊虎等[[17]]以人尿浓缩物为原料，利用纯胰蛋白酶作为配体偶联于CNBr-Sepharose-4B 为亲和载体，在不同条件下洗脱亲和蛋白，可从粗品溶液中快速分离纯化具有胰蛋白酶抑制活性的两种纯产物。

植物中存在胰蛋白酶抑制剂较多的是豆类植物，这也是当前研究热点。一般而言，从豆类种子中提取胰蛋白酶抑制剂主要分为粗提取和纯化两个部分，首先通过优化试验选择最优的提取剂（酸、碱、盐、缓冲液和蒸馏水）、最优的提取条件（温度、时间和pH），而后通过热变形处理（除去受热易凝聚的球蛋白等）、纳滤膜超滤（除热处理不能凝聚的或变性的小分子）或硫酸铵分级沉淀或等电点聚焦等方法除去杂蛋白以得到粗提液，然后进行凝胶过滤层析、离子交换层析或亲和色谱层析得到纯化的TI。武金霞等[[18]]以大豆为原料，蒸馏水浸提、饱和硫酸铝钾沉淀、等电点电泳和DEAE-Cellulose-32离子交换层析等方法进行纯化，SDS-PAGE电泳测定其分子量为20.1 kDa。付煊赫等[[19]]以鹰嘴豆为原料，鹰嘴豆种子经脱皮、脱脂，50 ℃蒸馏水浸提，35%~75%饱和度硫酸铵分步沉淀，经DEAE-52纤维素离子交换和Sephadex G-100分子筛层析，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳显示单一条带，得到分子量约为25.7 kDa的一种胰蛋白酶抑制剂。

微生物中也含有胰蛋白酶抑制剂，微生物来源的胰蛋白酶抑制剂主要分为两类：蛋白类和小分子类。微生物源蛋白类TI一部分是动植物源TI的同源蛋白，另一部分是只来源于微生物的蛋白质。小分子类抑制剂主要来源于链霉菌和蓝细菌，根据结构通常分为三类：肽醛类、环状缩肽类和线性类缩肽类。[[20]]

1.2.2胰蛋白酶抑制剂的应用

胰蛋白酶抑制剂可以与胰蛋白酶发生结合反应，调控酶的活性。已知TI主要来源于植物和动物，具有广泛的生物学活性，对急性胰腺炎、肺气肿、出血性和败血性休克等疾病有独特的疗效[[21]]，如：抑肽酶、乌司他丁（UTI）。目前研究热点是TI在抵抗肿瘤和消除炎症方面的应用。

胰蛋白酶抑制剂具有抗肿瘤作用，具有抑制肿瘤细胞的浸润和转移等功能。其中, 抑制肿瘤细胞的浸润和转移是胰蛋白酶抑制剂抗肿瘤活性的主要表现。[[22]]杜惠芬等[[23]]证实, 牛肺胰蛋白酶抑制剂能明显抑制肿瘤细胞降解基底膜的作用, 对SPCA- 1 细胞株降解人脐静脉内皮细胞株(ECV-304)基底膜的抑制率达54 %～61 %；对宫颈癌U14 细胞株降解人脐静脉内皮细胞株(ECV- 304)基底膜的抑制率达47 %～56 %。

在抗病毒方面，Evandro等[[24]]自豆类中提取了Kunitz型胰蛋白酶抑制剂，该抑制剂可以抑制对HIV-1增殖至关重要的HIV-1反转录酶的活性，从而使得此胰蛋白酶抑制剂具有了抑制HIV-1增殖的可能性。

　 重症急性胰腺炎（SAP）是一种起病快、病死率高的疾病，异常的胰酶激活在急性胰腺炎（AP）的初始、发生和后续发展过程中起到关键作用，如何抑制胰酶活性是SAP治疗的重要靶点之一,而胰蛋白酶抑制剂中的乌司他丁治疗SAP可以有效、快速地改善临床症状，减轻炎性反应，预防胰腺炎由轻症发展为重症，减少并发症和MODS（多器官功能衰竭）的发生，降低病死率。[[25]][[26]]

在抗病虫方面，有研究表明胰蛋白酶抑制剂与内源抗虫物质具有协调性，可增加抗虫性，因此如果将外源蛋白酶抑制剂的基因转入具有内源性抗虫次物质的植物，可能会获得具有高抗虫性的新品种。Hilder等[[27]]在豇豆烟草叶片中导入TI的基因后，其抗虫害性明显增强。由于转TI基因抗病虫杀虫更彻底，具有连续性、不污染环境、投资成本低等诸多优点，关于其研究也得到了广泛关注并取得了极大的进展，目前已在多种豆科植物中成功导入TI基因。

1.3卵类粘蛋白

卵类粘蛋白(ovomucoid , 简称OVM ,Gal d1)存在于蛋清之中，约占蛋清蛋白总量的11％，是一种含有20%-25%碳水化合物的高度糖基化蛋白质[[28]]，也是动物中存在的胰蛋白酶抑制剂的一种。它是导致部分人对鸡蛋过敏的一个重要过敏原。它是结构中含八个二硫键的糖蛋白，包含三个由二硫键连接的结构域，等电点为3.9至4.5，平均分子量约2.8kDa。该分子由186个氨基酸构成3个独立的串联同源结构域（结构域Gald 1.1,1.2,1.3），每个结构域之间由３个分子内二硫键连接。目前，卵类粘蛋白作为一种新型的蛋白质色谱填料，因其具有众多手性识别位点和较宽的对映选择范围[[29]][[30]]，已被应用于一些药物的手性拆分。

2、卵类粘蛋白的制备

本课题采用亲和层析的方法对卵类粘蛋白进行制备，亲和层析是根据生物活性物质与特异性配体间的特异性亲和力来达到分离目的一种技术，亲和层析是目前最为有效的蛋白质分离纯化方法[[31]]。亲和层析根据目标蛋白的专一性而设计，如酶与底物、抗原与抗体等。亲和层析具有高纯度、高收率以及能保持生物大分子的天然活性等优点，因此具有良好的选择性，被广泛的应用于从复杂体系中高效提取特定的目标蛋白。范俊虎等以人尿浓缩物为原料，利用纯胰蛋白酶作为配体偶联于CNBr-Sepharose-4B 为亲和载体，在不同条件下洗脱亲和蛋白，可从粗品溶液中快速分离纯化具有胰蛋白酶抑制活性的两种纯产物。本课题中同样采用已经用溴化氰活化过的琼脂糖凝胶（Sepharose 4B）为固相载体，在弱碱的条件下直接偶联胰蛋白酶的游离氨基，获得固定化酶，并用鸡蛋清进行亲和层析以获取卵类粘蛋白。相比于游离的胰蛋白酶，使胰蛋白酶固定化可以获得更高的热稳定性和pH稳定性，以此为配基通过亲和层析的方法纯化胰蛋白酶抑制剂，理论能够上获得较高的纯化倍数和抑制剂活力。

3、展望

胰蛋白酶抑制剂已经广泛应用于临床, 并取得了良好的医疗效果。但有时出现一些不良反应, 甚至威胁患者生命, 所以开发抗原性小的胰蛋白酶抑制剂应该受到关注。如开发植物来源的小分子胰蛋白酶抑制剂。随着研究的不断深入, 对不同来源的胰蛋白酶抑制剂的氨基酸组成、分子结构及抑制机制也不同程度地被阐明, 为它的应用提供了理论基础。而且, 在目前研究的基础上将现代生物技术应用于对胰蛋白酶抑制剂的研究, 从而考察不同来源的TI在结构、性质和生物学作用方面的异同, 将为TI在不同领域内的应用提供更为广泛的途径。

学生签名： 年 月 日

指导教师意见：

指导教师签名： 年 月 日

所在教研室（实习单位）审查意见：

负责人签名： 年 月 日

填写说明

1.指导教师意见填写对文献综述的评语，对本课题的深度、广度及工作量的意见和对论文结果的预测；

2.所在教研室（实习单位）审查意见包括对指导教师意见的认定和是否同意开题等。

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