重组肝素酶Ⅰ的表达与纯化文献综述

开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

1. 课题研究背景、意义及目的

肝素（Heparin）是一种由葡萄糖胺，L-艾杜糖醛酸、N-乙酰葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸交替组成的硫酸氨基葡聚糖，具有抗凝血、调血脂、抗炎等功能，在临床上是血栓栓塞性疾病、心肌梗死和血液透析等疾病的首选药物。但肝素的使用仍具有一定的副作用，最主要的是出血作用。由普通肝素解聚而成的低分子肝素（LMWH），作用机制是影响因子Xa活性，对凝血酶及其他凝血因子影响较小，保留肝素的抗血栓作用并降低了出血副作用。现制备工艺采用的化学降解法存在效率较低、降解过程可控性差、肝素活性功能团易被破坏和产品均一性较差等问题，因此采用肝素酶降解是生产低分子肝素技术发展的趋势。

肝素酶（Heparinase）是一类能够特异性裂解肝素和硫酸乙酰肝素主链糖苷键的酶，主要应用于制备低分子肝素，测定肝素分子结构，体外循环中清除肝等方面。目前从肝素黄杆菌中提取出的肝素酶，根据底物特异性不同可以分为Heparinase I( Hep I) 、 Heparinase II( Hep II) 、Heparinase III( Hep III)，其中的Hep I相对其他的酶而言，对底物肝素具有更高的专一性和活性，因而在低分子肝素生产制备上得以应用。分离Hep I、Hep II和Hep III的成本高昂，随着近几年的肝素黄杆菌同源表达肝素酶的载体的构建研究有所发展，异源重组表达Hep I的方案具有了可行性。而依靠基因工程手段直接在细菌中表达出的肝素酶水溶性差，阻碍了蛋白复性，所以构建能高效表达且易于分离的肝素酶的工程菌株成为了关键。

本实验目的是鉴定重组肝素酶Ⅰ工程菌，对重组肝素酶Ⅰ的表达纯化进行摸索，得到高效表达肝素酶融合蛋白。通过从肝素黄杆菌（Flavobacterium heparinum）中提取肝素酶基因，与融合伴侣GST结合重组入大肠杆菌中生产可溶性的融合肝素酶Ⅰ，并且通过GST亲和层析柱纯化蛋白并测定其活性。

1. 课题研究的主要内容

本课题建立在实验室已有的蛋白重组表达平台上，利用已有研究报道进行重组肝素酶Ⅰ的表达与纯化。主要研究内容包括：

1：肝素酶工程菌进行筛选鉴定

2：重组肝素酶Ⅰ大肠杆菌内表达:

3：GST亲和层析柱纯化及蛋白活性测定，并对方案进行优化。

1. 课题研究的进展计划

2020/03——2020/04 查询、阅读整理文献和实验设计方案及实验技能的训练

2020/04——2020/06 重组肝素酶Ⅰ的表达与纯化、蛋白活性测定、优化实验方案

2020/06——2020/06 整理实验记录、撰写毕业设计、准备毕业答辩

1. 文献综述：

重组肝素酶Ⅰ的表达与纯化

【摘要】肝素酶（Heparinase）是一类能够特异性裂解肝素和硫酸乙酰肝素主链糖苷键的酶。目前从肝素黄杆菌中提取出的肝素酶，根据作用位点可分为Hepar-inase I( Hep I) 、 Heparinase II( Hep II) 、Heparinase III( Hep III)，其中的Hep I对底物肝素具有更高的专一性和生物活性，因而在低分子肝素制备等方面应用。分离Hep I的成本高，但近几年的肝素黄杆菌同源表达肝素酶的载体的构建研究有所发展，重组表达Hep I的方案有了可行性。依靠基因工程直接表达出的肝素酶水溶性差，阻碍了蛋白复性，所以构建高效表达且易于分离肝素酶的工程菌株成为了关键。本实验通过从肝素黄杆菌（Flavobacterium heparinum）中提取肝素酶基因，与融合伴侣GST结合重组入大肠杆菌中生产可溶性的融合肝素酶Ⅰ，并且通过GST亲和层析柱纯化蛋白并测定其活性。

【关键词】肝素酶I，重组表达，融合蛋白，亲和纯化

【前言】

1. 前言

1.1肝素和低分子肝素

肝素（Heparin）最早于动物肝脏被发现而得名，也存在于肺、血管壁、肠粘膜等组织中，是动物体内一种天然抗凝血物质，主要由嗜碱性粒细胞和肥大细胞产生。肝素是一种由葡萄糖胺，L-艾杜糖醛酸、N-乙酰葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸交替组成的高度硫酸化的糖胺聚糖。肝素含10-30个二糖单位不等，分子量4000-20000，平均分子量为12000，主要单糖是2-O-硫酸-A-L艾杜糖醛酸和6-O-硫酸-N-硫酸-A-D葡萄糖胺，由它们构成的三硫酸二糖的重复单元构成了肝素的“规则区”，其为肝素结构的主要成分；另外的单糖残基，如A-L-艾杜糖醛酸，B-D 葡萄糖醛酸及3-6-双-O-硫酸-N-硫酸-A-D 葡萄糖胺等则以很低的频率出现于“非规则区”，因此肝素的精确结构尚不明确^[1]。肝素具有抗凝血、调血脂、抗炎以及抗过敏等功能，在临床上是血栓栓塞性疾病、心肌梗死和血液透析等疾病的首选药物，更是我国目前出口量最大的生化原料药。但肝素的使用仍具有一定的副作用，最主要的是出血作用。由普通肝素解聚而成的低分子肝素（LMWH），作用机制是影响因子Xa活性，对凝血酶及其他凝血因子影响较小，保留肝素的抗血栓作用并降低了出血副作用^[2]。现制备工艺采用的化学降解法存在效率较低、降解过程可控性差、肝素活性功能团易被破坏和产品均一性较差等问题，在全球肝素系列产品中，约三分之一的肝素原料药用于制成标准肝素制剂，其余约三分之二作为原料用于生产低分子肝素原料药，低分子肝素市场销售量已经占整个肝素市场容量的80% 左右^[3]。

1.2肝素酶

肝素酶（Heparinase）是一类能够特异性裂解肝素和硫酸乙酰肝素主链糖苷键的酶，主要应用于制备低分子肝素，测定肝素分子结构，体外循环中清除肝等方面。自从Payza等^[4]在肝素黄杆菌(Flavobacterium heparinum)中发现肝素酶以来,人们对肝素酶以及肝素酶生产菌作了广泛的研究,同时发现在许多微生物中都存在肝素酶。目前从肝素黄杆菌中提取出的肝素酶，根据底物特异性不同可以分为Heparinase I( Hep I) 、 Heparinase II( Hep II) 、Heparinase III( Hep III)，Hep I作用于2-O-硫酸-A-L艾杜糖醛酸和6-O-硫酸-N-硫酸-A-D葡萄糖胺形成的糖苷键；Hep III的作用位点在N-乙酰化寡糖区域； Hep II则同时具有Hep I和Hep III的活性。Hep I相对其他的两种酶而言，对底物肝素具有更高的专一性和活性，因而在低分子肝素生产制备上得以应用^[5]。分离Hep I、Hep II和Hep III的成本高昂，但近几年的肝素黄杆菌同源表达肝素酶的载体的构建研究有所发展，使得重组表达Hep I的方案具有了可行性。

通过基因工程直接表达出的肝素酶水溶性差，阻碍了蛋白结构的完整形成。Ernst和Sasisekharan^[6][7]首次克隆了 HepⅠ基因,但活性很低,大都形成无活性的包涵体。后来有人尝试以融合蛋白的形式表达肝素酶，1999年Shpigel等^[8]将HepⅠ与纤维素结合蛋白（CBD）在大肠杆菌内一起融合表达，肝素酶依旧以包涵体形式存在，但复性后具备了降解肝素和结合纤维素的双重活性。2005年陈银等^[9]将HepⅠ与麦芽糖结合蛋白（MBP）以融合蛋白的形式在大肠杆菌中表达，其生物学特性除与底物的亲和力下降外，其他特征与肝素黄杆菌来源肝素酶相似。此外，Esposito^[10]提到的谷胱甘肽巯基转移酶（GST）、硫氧还蛋白（TrX）、小分子泛素修饰体（SUMO）、二硫键异构酶（DsbC）等在融合蛋白的表达中表现出了较好的增溶效果。

2.重组肝素酶Ⅰ的表达^[11]

通过从肝素黄杆菌（Flavobacterium heparinum）中提取肝素酶基因，将肝素酶Ⅰ与谷胱甘肽-S-转移酶(GST)进行融合表达，生产可溶性的融合肝素酶Ⅰ，并采用诱导后低温培养的方式实现肝素酶Ⅰ的可溶性表达。野生型肝素黄杆菌的 Heparinase I 产量低,优化工艺复杂,而先前克隆表达的 Hep I 则活性低，且包涵体含量相对较高。Chuan Zhang等^[12]通过同源建模、多序列比对、分子对接和定点诱变来提高Ph-HepI的特异性酶活性，实验结果中有三种突变体的比酶活性和产率得到提高。可设计正交实验，对于各因素筛选比较进行方案优化。

学生签名：林苏铭 2020年 03 月 19 日

指导教师意见：

指导教师签名： 年 月 日

所在教研室（实习单位）审查意见：

负责人签名： 年 月 日