开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
糖尿病是一种以高血糖为主要特征的胰岛素分泌不足或胰岛素行为缺陷所导致的代谢性疾病，大致分为Ⅰ型糖尿病、Ⅱ型糖尿病和妊娠糖尿病。Ⅰ型糖尿病为胰岛素依赖型糖尿病，其发病原因是由于胰岛组织受损而导致胰岛素分泌不足，治疗方法主要以注射胰岛素为主。Ⅱ型糖尿病为胰岛素耐受性糖尿病，表现为机体细胞不能正常的接受胰岛素对其的调控，进而出现细胞糖代谢活动紊乱。妊娠期糖尿病则主要表现为无糖尿病病史的女性在怀孕后出现血糖升高的现象。胰岛组织由许多分泌细胞组成，他们具有维持机体内稳态的功能。其中，beta;细胞是起主导作用的胰岛细胞类型，其根据体内葡萄糖含量来合成和分泌胰岛素，进而调节和维持机体葡萄糖内稳态[1,2]。当beta;细胞的功能受到干扰致使胰岛素分泌不足时，便会引发糖尿病[3]。目前已有研究证明有一系列特异性转录因子的激活或阻遏作用会影响胰岛细胞的增殖和分化，例如胰十二指肠同源框因子-1(Pdx-1)，神经原素3(neurogenin 3,Ngn3)和神经分化因子-1(Neurogenic differentiation 1,NeuroD1)[4]。
NeuroD1又名beta;细胞E盒转录激活因子-2（Beta2,beta;2），研究发现NeuroD1基因突变与成人型糖尿病的发病密切相关。NeuroD1属于B类bHLH转录因子家族，可与同属的A类bHLH蛋白E47结合形成异二聚体，其与E盒具有高亲和力。NeuroD1通过与靶基因的特定序列结合，可以调控与细胞分化有关的基因表达，影响机体的正常发育。在神经系统发育时，其可在神经元细胞有丝分裂期和之后进行表达，已有研究证实NeuroD1对小脑和齿状回的粒细胞增殖和分化过程有着独特的作用[5]。同时，它也是胰岛素基因的重要转录激活因子，其突变可导致Ⅱ型糖尿病发生。
MicroRNAs（miRNAs），即微小RNA，是一类内源性非编码小RNA（small non-coding RNA），长度为21~25nt，可与靶基因mRNA的3UTR区完全或部分互补，通过降解靶基因mRNA或阻遏其相关蛋白翻译过程来下调靶基因的表达。已有研究证实MiR-375可调节胰岛素分泌和维持alpha;与beta;细胞团块[6]，MiR-15,MiR-16和MiR-195可靶向结合Ngn3以影响胰腺再生[7],MiR-124a可以抑制MIN6细胞中Foxa2的表达[8]。miRNA对于调节胰腺组织功能发挥着重要作用，而它们如何影响胰岛细胞的增殖和分化仍是一个亟待解决的问题。
课题组在前期通过高通量测序分析胰岛细胞与外分泌细胞中差异的miRNA，结果显示miR-802在胰岛细胞中低表达，而NeuroD1的表达量升高，这表明miR-802可能与NeuroD1协同作用调控胰岛功能。因此，本研究通过双荧光素酶报告基因法、q-PCR和western blotting等实验方法，验证miR-802/NeuroD1是否存在靶向性，以期探索miRNA调控胰岛b细胞功能的作用机制。
实验方法：
（一）双荧光素酶报告基因法验证miR-802/NeuroD1的靶向性
双荧光素酶报告基因检测法使用含萤火虫荧光素酶的质粒为报告质粒，以含海肾荧光素酶的质粒为内参质粒，构建野生型和突变型的靶序列重组报告质粒。分别将miR-802 mimics,miR-802 negative control,miR-802 inhibitor,miR-802 inhibitor negative control 同上述报告质粒和内参质粒共同转染293T细胞，培养24h后通过测量萤火虫荧光素酶/海肾荧光素酶的相对荧光值来验证miR-802与NeuroD1是否具有靶向结合的能力。
在本实验中将运用到细胞传代培养技术,利用Bibiserve计算以预测二者结合的自由能,靶序列-报告重组质粒的构建,感受态细胞DH5alpha;的制备,转化,脂质体转染293T细胞,荧光素酶活性测定等。
