- 研究的问题及内容
细胞增殖是细胞生命活动的重要特征之一,它是多细胞生物生长和繁殖的基础。细胞增殖最直观的表现是细胞分裂。通常,我们将从一次细胞分裂结束开始,经过物质准备,到下一次细胞分裂结束为止,称为一个细胞周期。随着生物学的不断发展,人们对细胞周期的研究越来越深入。其中,在细胞周期中发挥关键作用的一类蛋白逐渐成为了研究的热点。细胞周期M期中,有一些蛋白会发生糖基化,如Bub1、Bub3、CDK、Mavs等,但有些蛋白的功能还不甚清楚。本课题将从此着眼点入手,将细胞同步化后运用一定的方法手段找出M期特异的发生O-乙酰糖基化的蛋白质,之后利用多种手段及方法学分析,研究该种特异蛋白的在细胞周期调控中发挥的功能。该课题需要学生具备多种实验能力,如细胞培养、周期同步化、质谱分析、功能鉴定等,需要学生具备一定调研分析能力及科学思维。
二、采用的研究手段
1.具备细胞培养的相关理论与实验技术,如:细胞间无菌操作、熟练使用显微镜、细胞接种、细胞消化及培养、人工同步化等。
2.免疫沉淀:免疫沉淀是利用抗体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种方法。抗体与细胞裂解液或表达上清中相应的蛋白结合后,再与蛋白A/G(ProteinA/G)或二抗偶联的agarose或Sepharose珠子孵育,通过离心得到珠子-蛋白A/G或二抗-抗体-目的蛋白复合物,沉淀经过洗涤后,重悬于电泳上样缓冲液,煮沸5-10min,在高温及还原剂的作用下,抗原与抗体解离,离心收集上清,上清中包括抗体、目的蛋白和少量的杂蛋白。
3.质谱分析:质谱(又叫质谱法)是一种与光谱并列的谱学方法,通常意义上是指广泛应用于各个学科领域中通过制备、分离、检测气相离子来鉴定化合物的一种专门技术。质谱法在一次分析中可提供丰富的结构信息,将分离技术与质谱法相结合是分离科学方法中的一项突破性进展。在众多的分析测试方法中,质谱学方法被认为是一种同时具备高特异性和高灵敏度且得到了广泛应用的普适性方法。质谱仪器一般由样品导入系统、离子源、质量分析器、检测器、数据处理系统等部分组成。
4.RNA干扰(RNA interference, RNAi):是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。基因沉默,主要有转录前水平的基因沉默(TGS)和转录后水平的基因沉默(PTGS)两类:TGS是指由于DNA修饰或染色体异染色质化等原因使基因不能正常转录;PTGS是启动了细胞质内靶mRNA序列特异性的降解机制。有时转基因会同时导致TGS和PTGS。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达,(长度超过三十的dsRNA会引起干扰素毒性)所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的治疗领域。
- 文献综述
M期特异蛋白质糖基化位点鉴定及功能研究
一些蛋白质翻译后可以发生糖基化修饰,即将UDP-GlcNAc中的beta;-N-乙酰氨基葡萄糖添加到丝氨酸/苏氨酸的羟基端产生一个O-乙酰糖基化的蛋白复合物。这种可逆的修饰和磷酸化修饰过程是很类似的,同样参与到许多重要的细胞生命活动中,如细胞信号转导、应激反应、细胞生长、蛋白-蛋白相互作用等。UDP-GlcNAc也同样参与到许多重要的代谢通路中,如:葡萄糖代谢、氨基酸代谢、核苷酸代谢及脂肪酸代谢等。因为UDP-GlcNAc在多种代谢中起着重要作用,所以对于蛋白质的O-乙酰糖基化的研究可以帮助我们了解许多代谢性疾病,如糖尿病、神经退行性疾病、癌症等。据2011年美国生物化学与分子生物学会报道,组蛋白O-乙酰糖基化水平在G1期细胞中很高,在S期下降,在S/G2转换期又升高,并一直持续到有丝分裂期。由此提示,M期特异蛋白质发生O-乙酰糖基化可能对细胞周期进程和各相的转换起着重要的调控作用。
蛋白质发生O-乙酰糖基化的水平主要由两个进化上较保守的酶所调控——OGT和OGA。OGT的数量在M期会发生下降,作用是催化O-乙酰葡糖胺基团添加到核蛋白或胞浆蛋白的丝/苏氨酸残基上。OGT适当的过表达可以在组蛋白H3的Lys-9,Ser-10,Arg-17和Lys-27位改变其翻译后修饰并可以抑制磷酸化的发生。研究显示,果蝇的OGT由PcG所编码,且多线染色体上O-GlcNAc修饰位点与PcG结合位点是一致的。由此可见,有丝分裂时,OGT在确保染色体分离中起着关键的作用。近期的研究表明,O-乙酰糖基化和OGT可以通过调节染色体重组酶的活性来影响染色体的结构。有趣的是,在异染色质中,O-乙酰糖基化的水平很高,而在有转录活性的染色质中,O-乙酰糖基化的水平是很低的。而且,RNA聚合酶II和许多转录因子都具有O-乙酰糖基化的修饰。OGT和OGA除了具有催化功能外,还以它们多功能的结构域参与到O-GlcNAc循环中去分散细胞内位点,从而监测脱乙酰酶、激酶和磷酸酶等活性的变化。这样一种靶向了O-GlcNAc循环的局部的信号变化影响了许多重要的细胞生命活动,如脂滴的重塑、线粒体的功能、表观遗传等。其中,参与O-乙酰糖基化的酶类含量也和细胞的营养状况相关。
生命是从一代向下一代传递的连续过程,因此是一个不断更新、不断从头开始的过程。细胞的生命开始于产生它的母细胞的分裂, 结束于它的子细胞的形成,或是细胞的自身死亡。通常将子细胞形成作为一次细胞分裂结束的标志,细胞周期是指从一次细胞分裂形成子细胞开始到下一次细胞分裂形成子细胞为止所经历的过程。在这一过程中,细胞的遗传物质复制并均等地分配给两个子细胞。
以上是文献综述,课题毕业论文、任务书、外文翻译、程序设计、图纸设计等资料可联系客服协助查找。